異氟醚吸入麻醉調控星形膠質細胞活化對圍術期小鼠神經認知功能的影響

彭 景，徐蘭真

圍術期神經認知紊亂(perioperative neurocognitive disorder，PND)是圍術期發生的以學習記憶等認知功能下降為主要表現的神經精神并發癥，發生率約為10%。老年患者術后1周PND發病率可達25.80%，約為青年患者10倍以上。PND發病機制尚未完全明確。越來越多證據顯示，麻醉應激反應是PND的重要誘因。異氟醚具有血/氣分布系數小、麻醉誘導平穩、迅速且舒適、肝臟代謝率低等優點，為目前臨床常用的吸入性全身麻醉藥物。但近年臨床應用發現，異氟醚可通過抑制突觸前膜對興奮性遞質谷氨酸釋放，增加突觸后膜對谷氨酸攝取，改變N-甲基-D-天門冬氨酸受體亞基構成，進而影響相關記憶形成過程。星形膠質細胞是哺乳動物腦內分布最廣泛的腦細胞，亦是體積最大的膠質細胞。既往研究表明，星形膠質細胞可通過調節突觸可塑性，與神經元形成代謝偶聯，維持神經系統內環境穩態。有研究發現，星形膠質細胞活化與PND發生密切相關。本研究旨在探討異氟醚是否通過調控星形膠質細胞活化對圍術期小鼠神經認知功能影響，為防治PND提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 C57BL/6小鼠 80只，SPF級，雄性，16月齡，平均體質量(44.69±1.32)g，購自武漢大學動物實驗中心，實驗動物許可證號SCXK(鄂)2019-0004。分籠喂養，適應性喂養1周后進行相關實驗，環境溫度(24±2)℃，相對濕度60%～70%，光照/黑暗各12 h，自由飲食和飲水。

1.1.2 試劑與儀器 異氟醚(國藥準字X19990127)：美國Abbott Laboratories公司。RIPA裂解液(貨號XG-R95815)、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(貨號XG-X6561)：上海西格生物科技有限公司。Triton X-100溶液(貨號R00284)：北京雷根生物技術有限公司。小鼠BCA蛋白ELISA試劑盒(貨號YT14144)、山羊血清(貨號YT2517)：北京伊塔生物科技有限公司。小鼠抗TNF-α單克隆抗體(貨號ab1793)、小鼠抗IL-6單克隆抗體(貨號ab9324)、小鼠抗Caspase-3單克隆抗體(貨號ab208161)、兔抗β-actin多克隆抗體(貨號ab8227)、小鼠抗GFAP單克隆抗體(貨號ab279290)、山羊抗小鼠IgG H&L二抗(貨號ab96879)：美國Abcam公司。DAPI染液(貨號EY19202)：上海一研生物科技有限公司。小鼠IgG-ECL顯色試劑盒(貨號SW2010)：北京索萊寶科技有限公司。水迷宮：上海玉研儀器公司，內徑120 cm，高50 cm，站臺直徑6～9 cm。激光共聚焦顯微鏡(型號SP8 X)：北京德利卡生物技術有限公司。全自動凝膠成像分析系統(型號ZF-288)：上海金鵬分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備小鼠隨機分為對照組、2%異氟醚組、手術組、2%異氟醚+手術組，每組20只。對照組小鼠以4%水合氯醛，腹腔注射，0.2 ml/20 g，吸入30% O-空氣2 h，假手術。2%異氟醚組小鼠以4%水合氯醛，腹腔注射，0.2 ml/20 g，吸入30% O-空氣和2%異氟醚2 h，假手術。手術組小鼠以4%水合氯醛，腹腔注射，0.2 ml/20 g，吸入30% O-空氣2 h，行脛骨骨折切開復位固定術。2%異氟醚+手術組小鼠以4%水合氯醛，腹腔注射，0.2 ml/20 g，吸入30% O-空氣和2%異氟醚2 h，行脛骨骨折切開復位固定術。

1.2.2 術后認知功能 通過Morris水迷宮實驗評估小鼠術后1、3、7 d認知功能。水池內注入25 ℃溫水，水深25 cm，平臺低于水面1 cm以上；將小鼠置于隨機象限，術前1 d訓練小鼠站臺，隨后記錄術后1、3、7 d小鼠找到平臺所用的時間，即為逃避潛伏期，以及小鼠在平臺所在象限停留時間，即為目標象限停留時間；實驗期間保持環境安靜，避免干擾其活動。

1.2.3 標本采集 Morris水迷宮實驗結束后，4%水合氯醛，腹腔注射，麻醉后斷頸處死小鼠，取完整腦組織；冰上分離雙側海馬組織，-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.4 蛋白免疫印跡法 取海馬組織，RIPA溶液裂解組織，提取總蛋白，BCA法進行蛋白定量；取40 μg蛋白樣品，SDS-PAGE電泳后，濕法轉至PVDF膜；5%脫脂奶粉，室溫封閉1 h；分別滴加TNF-α、IL-6和Caspase-3抗體，1∶2000，內參為β-actin，1∶45 000，4 ℃過夜孵育；TBST洗膜2次，每次5 min；ECL法顯影，凝膠成像系統觀察，Image J軟件定量分析蛋白相對表達量。

1.2.5 免疫熒光染色 取海馬組織，4%多聚甲醛固定48 h，0.9%無菌氯化鈉溶液漂洗30 min；常規制備石蠟切片，厚度5 μm；二甲苯脫蠟，乙醇溶液梯度水化，擦拭切片周圍液體；免疫組化筆距離組織2 mm處畫圈；置于0.4%Triton X-100溶液中，室溫孵育10 min，PBS溶液沖洗3次，每次5 min；修復抗原，高壓鍋加熱至限壓閥冒氣90 s，冷水降壓，自然冷卻后，PBS溶液沖洗3次，每次5 min；滴加5%山羊血清，37 ℃封閉10 min；滴加小鼠GFAP單克隆抗體，4 ℃過夜孵育；滴加山羊抗小鼠IgG H&L二抗，37 ℃避光孵育1～2 h；棄去抗體反應液，置于脫色搖床上，PBS溶液沖洗3次，每次5 min；阻水圈內滴加DAPI染液，避光孵育5 min；PBS溶液沖洗3次，每次5 min；90%甘油封片，激光共聚焦顯微鏡(400×)下觀察GFAP陽性細胞數，并拍照。

1.2.6 TUNEL法檢測細胞凋亡 取海馬組織石蠟切片，依次脫蠟、水化；置于蛋白酶K工作液，室溫反應15～30 min；滴加TUNEL反應液，室溫避光孵育60 min；PBS溶液沖洗3次，每次5 min；熒光顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野，計數TUNEL陽性細胞。

2 結 果

2.1 小鼠術后認知功能比較 術后1、3、7 d，與對照組比較，2%異氟醚組和手術組小鼠逃避潛伏期顯著增加，目標象限停留時間顯著縮短(<0.05)；術后1、3、7 d，與2%異氟醚組和手術組比較，2%異氟醚+手術組小鼠逃避潛伏期顯著延長，目標象限停留時間顯著減少(<0.05，表1)。

2.2 小鼠術后海馬組織炎性反應和凋亡相關因子水平比較 術后1、3、7 d，與對照組比較，2%異氟醚組和手術組小鼠海馬組織TNF-α、IL-6和Caspase-3表達水平顯著升高(<0.05)；術后1、3、7 d，與2%異氟醚組和手術組比較，2%異氟醚+手術組小鼠海馬組織TNF-α、IL-6和Caspase-3表達水平均顯著升高(<0.05，表2)。

2.3 小鼠術后海馬組織星形膠質細胞活化情況比較 術后1、3、7 d，與對照組比較，2%異氟醚組和手術組小鼠海馬組織GFAP陽性細胞數顯著增加(<0.05)；術后1、3、7 d，與2%異氟醚組和手術組比較，2%異氟醚+手術組小鼠海馬組織GFAP陽性細胞數顯著增加(<0.05，表3，圖1)。

2.4 小鼠術后海馬神經元細胞凋亡比較 術后1、3、7 d，與對照組比較，2%異氟醚組和手術組小鼠海馬神經元細胞凋亡率顯著增高(<0.05)；術后1、3、7 d，與2%異氟醚組和手術組比較，2%異氟醚+手術組小鼠海馬神經元細胞凋亡率顯著增高(<0.05，表4)。

3 討 論

PND是麻醉手術后常見的中樞神經系統并發癥，主要表現為學習、記憶、注意力等認知功能下降。大多學者認為，神經炎性反應和星形膠質細胞活化是PND發生以及進展的重要原因。異氟醚是一種臨床常用的吸入性麻醉藥物，其麻醉效能介于氟烷和安氟醚間，安全性和可控性相對較高。但研究發現，異氟醚吸入麻醉過程中，對中樞神經系統具有抑制作用，且抑制程度與吸入濃度呈顯著正相關。馮海妹等發現，異氟醚麻醉可通過激活糖原合成酶激酶-3β活性，誘發老齡大鼠認知功能障礙和炎性反應。Miao等亦發現，異氟醚和手術可降低AD轉基因小鼠突觸后密度-95、突觸素和三磷酸腺苷水平，增加Barnes迷宮探針試驗的逃逸潛伏期和逃逸距離，導致小鼠大腦能量不足進而引發認知障礙。

馬斌等分析了不同濃度和作用時間異氟醚對幼年小鼠神經功能影響發現，相較于1.5%異氟醚，2%異氟醚吸入麻醉2 h可顯著引起小鼠神經細胞凋亡，導致神經認知功能損傷。故本研究采用2%異氟醚作為實驗劑量，進一步分析異氟醚對圍術期小鼠認知功能的影響及機制。Morris水迷宮實驗是研究空間學習記憶相關腦區功能的方法。秦起等發現，麻醉手術可引起大鼠逃避潛伏期顯著延長，目標象限活動時間顯著縮短。本研究中，術后1、3、7 d，與對照組比較，2%異氟醚組和手術組小鼠逃避潛伏期顯著增加，目標象限停留時間顯著減少，符合以往研究結果，提示麻醉和手術應激可引起圍術期小鼠認知功能下降；而與2%異氟醚組和手術組比較，2%異氟醚+手術組小鼠術后1、3、7 d逃避潛伏期進一步增加，目標象限停留時間進一步減少，提示異氟醚吸入麻醉具有加重小鼠認知功能下降作用。

麻醉藥物對機體代謝具有一定影響，可誘發應激反應和炎性反應。文獻[16]報道，異氟醚麻醉下行肝部分切除術可導致老年大鼠海馬炎性反應。有研究報道，異氟醚麻醉下行肝部分切除術可導致老年大鼠海馬炎性反應。Miles等發現，異氟醚吸入麻醉可導致顱內手術患者腦脊液TNF-α和IL-6等炎性因子水平顯著升高，并在術后神經損傷中發揮重要作用。本研究發現，術后1、3、7 d，與對照組比較，2%異氟醚組和手術組小鼠海馬組織TNF-α、IL-6和Caspase-3表達水平和海馬神經元細胞凋亡率顯著升高，符合以往研究結果，提示麻醉和手術應激可誘發機體炎性反應及神經元細胞凋亡；而與2%異氟醚組和手術組比較，2%異氟醚+手術組小鼠術后1、3、7 d海馬組織TNF-α、IL-6和Caspase-3表達水平和海馬神經元細胞凋亡率進一步升高，且海馬星形膠質細胞減少，GFAP陽性細胞數顯著增加，表明異氟醚吸入麻醉可加重圍術期小鼠神經炎性反應及神經元細胞凋亡水平，機制可能與促進海馬星形膠質細胞活化有關。

綜上所述，異氟醚吸入麻醉可引起圍術期小鼠認知功能下降，其機制可能與促進海馬星形膠質細胞活化，誘導神經元凋亡，加重神經炎性反應水平有關。線粒體是細胞物質和能量代謝的中心，線粒體能量代謝紊亂亦是導致PND發生的重要因素。本研究未驗證和探討異氟醚對線粒體能量代謝的影響及其機制，擬在今后研究中進一步分析。