蟲草益腎顆粒對高糖條件下腎小球系膜細胞氧化應激及p22phox表達的影響

劉爽 宋立群

1.浙江中醫藥大學附屬第三醫院 杭州 310005 2.黑龍江中醫藥大學

糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是終末期腎臟病（end stage renal disease，ESRD）的主要原因，30%～40%的糖尿病患者會發生DKD[1]。有研究發現，DKD病理改變的主要原因是人腎小球系膜細胞（human glomerular mesangial cells，HMCs）的異常增殖[2]，因此本研究以HMCs作為研究對象。氧化應激反應在DKD的發生發展中起著重要作用，氧化應激的增強可導致活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的過量產生，引起中性粒細胞發生炎性浸潤，產生大量氧化中間產物，最終導致組織細胞損傷[3-6]。生理情況下，ROS的清除與生成處于一種動態平衡狀態；而在病理情況下，當組織中生成的ROS超過了抗氧化系統的清除能力時，就會發生氧化應激反應。腎臟中的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 （nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶是參與ROS生成的主要氧化酶之一[7]，p22phox是NADPH氧化酶的亞單位，主要存在于細胞膜上，當NADPH氧化酶激活后，p22phox表達升高，并在短時間內產生大量的ROS。因此，抑制NADPH氧化酶表達可以抑制ROS產生，從而避免氧化應激反應造成的腎臟損傷，并最終抑制DKD進一步發展[8-10]。蟲草益腎顆粒為宋立群教授應用多年的臨床經驗方，在治療DKD方面療效顯著。前期研究發現，蟲草益腎顆粒可通過抑制自由基引起的脂質過氧化反應，促進過氧化氫酶（catalase，CAT）的活性，從而提高機體抗氧化能力[11]。本研究通過觀察蟲草益腎顆粒含藥血清對高糖條件下HMCs增殖和氧化應激的影響，進一步探究蟲草益腎顆粒防治DKD的作用機制，為蟲草益腎顆粒治療DKD提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性無特定病原體 （specific pathogen free，SPF）級Wistar大鼠50只，10周齡，體質量200～220 g，購買并飼養于黑龍江中醫藥大學實驗中心[實驗動物使用許可證號碼：SYXK（黑）2017-010]。實驗動物的使用嚴格按照《關于善待實驗動物的指導性意見》的有關規定進行。

1.2 干預藥物 蟲草益腎顆粒組成：生黃芪30 g、制大黃10 g、水蛭3 g、貓須草20 g、蟲草菌絲粉10 g，所有中藥購于黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院中藥房。將上方煎煮、濃縮后制成顆粒劑，規格為12 g/袋。福辛普利購于黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院西藥房（商品名：蒙諾，規格：10 mg/片，批號：1705054）。

1.3 主要試劑和儀器 洛斯維爾·帕克紀念研究所（Roswell Park Memorial Institute，RPMI）1640培養液及胎牛血清均購于Gibco公司（批號：11875-093、10091-148）；細 胞 增 殖 檢 測 （cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒購于Biosharp公司（批號：BS350B）；葡萄糖干粉購于Sigma公司（批號：G7528）；總RNA提取試劑購于上海拜力生物科技有限公司（批號：BL201704）；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR）試劑盒購于深圳市康百得生物科技有限公司（批號：20170428）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒購于哈爾濱海基公司 （批號：20160516）；p22phox抗體購于Abcam公司 （批號：ab75941）。 Mini-Opticon2型PCR儀購于美國應用生物系統公司；EPICSXL型流式細胞儀為美國Beckmann Coulter公司產品；UVP-200凝膠成像系統購于美國UVP公司；Multiskan 354酶標儀為芬蘭Labsystems公司產品。

1.4 方法

1.4.1 蟲草益腎顆粒含藥血清的制備 50只大鼠適應性喂養7 d，隨機分為正常組，福辛普利組，蟲草益腎顆粒高、中、低劑量組，每組10只。根據《藥理實驗方法學》[12]計算得出大鼠福辛普利的成人臨床等效劑量為0.9 mg·kg-1，以成人臨床等效劑量為蟲草益腎顆粒低劑量組，中劑量組與高劑量組分別為低劑量組的2倍和4倍。正常組予0.9%氯化鈉溶液灌胃，福辛普利組以0.9mg/（kg·d）灌胃，蟲草益腎顆粒低、中、高劑量組分別以3.24 mg/（kg·d）、6.48 mg/（kg·d）、12.96 mg/（kg·d）灌胃。各組大鼠飼養環境及條件相同，持續干預7 d后，于末次給藥后2 h眼眶取血，3 000 r·min-1離心15 min，分離血清，56℃、30 min滅活，無菌條件下過濾除菌，分裝后-80℃保存備用。

1.4.2 細胞培養 HMCs由哈爾濱醫科大學附屬第二醫院惠贈，于37℃含5% CO2的培養箱中培養，培養至對數生長期時開始實驗。

1.4.3 分組與給藥 將HMCs隨機分為6組：正常組，高糖組（加入30 mmol·L-1葡萄糖），福辛普利組（加入10%福辛普利組大鼠含藥血清），蟲草益腎顆粒低、中、高劑量組（分別加入10%蟲草益腎顆粒低、中、高劑量組大鼠含藥血清）。

1.4.4 指標檢測

1.4.4.1 細胞增殖檢測 以CCK-8試劑盒檢測各組細胞的增殖情況。將對數生長期HMCs接種于96孔板，調節細胞密度為7～8×103/孔，每孔100 μL，置于37℃、5% CO2培養箱。每個時間點分別設10個復孔，培養至24、48、72 h時，分別加入10 μL/孔的CCK-8溶液，繼續孵育4 h。4 h后取出，酶標儀檢測450 nm波長處吸光度。

1.4.4.2 各組細胞ROS的表達情況 HMCs以1×105個/mL接種于6孔板，于培養箱中培養48、72 h后，以流式細胞儀檢測各組ROS水平。

1.4.4.3 Real-time qPCR檢測各組細胞p22phox的mRNA表達 收集細胞，提取RNA并定量，根據試劑盒說明書將所獲得的RNA逆轉錄為cDNA，以β-actin為內參，進行擴增，反應條件為95℃ 15 min，95℃10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環，每個樣品各設3個復孔，以2-△△ct計算mRNA的相對表達量。引物設計和合成均由日本Takara公司完成，序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.4.4.4 免疫印跡法檢測各組細胞p22phox的蛋白表達 收集細胞，提取總蛋白并進行蛋白定量后，按每孔50 μg上樣，行十二烷基磺酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳 （sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳，轉膜后以5%脫脂奶粉配制的含有Tween的tris緩沖液（tris buffer solution Tween，TBST）封閉1 h，加入一抗（稀釋比例：1∶1 000），室溫搖床孵育2 h后洗滌3次；加入二抗（稀釋比例：1∶5 000），孵育1 h后洗滌3次，以β-actin作為內參，加入電化學發光液顯色1 min，攝片掃描后用Image-Pro Plus 5.0軟件計算條帶相對灰度值。

1.5 統計學分析 應用SPSS 16.0統計軟件進行統計學分析，以GraphPad Prism 5.0軟件進行圖表處理。計量資料以±s表示，不同組同一時間點及同一組不同時間點差異比較采用單因素方差分析，多個樣本均數間兩兩比較采用最小顯著差異法（least significant difference-t，LSD-t）檢驗。 以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 正常組與高糖組細胞不同時間點增殖情況比較

隨著培養時間延長，正常組和高糖組細胞數量明顯增加，各時間點比較差異均有統計學意義（P＜0.01）。其中，正常組和高糖組在48 h時的增速均最高，隨后便進入增殖平臺期，速度逐漸趨于平緩；在各個時間段內，高糖組HMCs增殖速度始終高于正常組，不過在48～72 h時間段內，高糖組的HMCs增殖速度與正常組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 正常組與高糖組細胞不同時間點增殖情況比較Fig.1 Comparison of cell proliferation between normal group and high glucose group at different time points

干預24 h后，與高糖組比較，蟲草益腎顆粒低、中劑量組及福辛普利組的HMCs增殖水平差異無統計學意義（P＞0.05），而蟲草益腎顆粒高劑量組的HMCs增殖水平明顯低于高糖組，差異有統計學意義（P＜0.05），說明干預24 h后，蟲草益腎顆粒高劑量組對HMCs增殖的抑制效果明顯。干預48、72 h后，與高糖組比較，蟲草益腎顆粒低、中、高劑量組及福辛普利組均明顯抑制了HMCs增殖，差異具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。 見表2。

表2 各組細胞增殖比較Tab.2 Comparison of proliferation in each group（±s，n=10）

表2 各組細胞增殖比較Tab.2 Comparison of proliferation in each group（±s，n=10）

注：與正常組同時點比較， ##P＜0.01；與高糖組同時點比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。Note:Compared with normal group at the same time， ##P＜0.01;compared with high glucose group at the same time， ▲P＜0.05， ▲▲P＜0.01.

組別 2 4 h 4 8 h 7 2 h正常組 0.3 3 9±0.0 8 5 0.9 7 5±0.1 3 6 0.9 8 8±0.0 9 4高糖組 0.6 6 3±0.1 0 8## 1.3 7 3±0.0 9 8## 1.3 9 3±0.0 6 9##福辛普利組 0.5 7 3±0.1 1 9## 1.2 1 5±0.1 0 8##▲▲ 1.1 1 1±0.1 2 2##▲▲蟲草益腎顆粒低劑量組 0.6 3 3±0.1 0 0## 1.2 5 1±0.1 1 7##▲ 1.2 0 6±0.0 5 1##▲▲蟲草益腎顆粒中劑量組 0.6 1 4±0.0 9 9## 1.2 2 1±0.1 1 6##▲ 1.1 4 9±0.0 6 9##▲▲蟲草益腎顆粒高劑量組 0.5 1 5±0.0 5 5##▲ 1.1 8 4±0.0 9 3##▲▲ 1.0 9 6±0.0 5 9##▲▲

2.2 各組細胞ROS表達比較 與正常組比較，相同時點高糖組的ROS表達量明顯增高（P＜0.01）。與高糖組比較，各藥物干預組ROS表達量明顯降低（P＜0.01），表明藥物干預有效。與福辛普利組比較，干預48 h后，蟲草益腎顆粒各劑量組ROS表達差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05），其中高劑量組的ROS表達量低于福辛普利組，表明蟲草益腎顆粒高劑量組療效相比福辛普利組更佳；干預72 h后，蟲草益腎顆粒中、高劑量組的ROS表達量均低，且差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），表明隨著藥物干預時間延長，中、高劑量的蟲草益腎顆粒組抑制ROS表達的效果高于福辛普利組。見表3。

表3 各組細胞ROS表達比較Tab.3 Comparison of ROS expression in each group （±s，n=6）

表3 各組細胞ROS表達比較Tab.3 Comparison of ROS expression in each group （±s，n=6）

注：與正常組同時點比較，##P＜0.01；與高糖組同時點比較，▲▲P＜0.01；與福辛普利組同時點比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。Note:Compared with normal group at the same time， ##P＜0.01;compared with high glucose group at the same time， ▲▲P＜0.01;compared with Fosinopril group at the same time， △P＜0.05， △△P＜0.01.

R O S/%4 8 h 7 2 h正常組 6.4 5±0.6 2 8.4 7±1.3 3高糖組 2 7.1 5±1.9 9## 3 0.4 5±2.1 5##福辛普利組 1 3.4 8±1.1 0##▲▲ 1 7.5 8±0.7 0##▲▲蟲草益腎顆粒低劑量組 1 7.4 3±0.7 8##▲▲△△ 2 0.1 5±1.7 1##▲▲△△蟲草益腎顆粒中劑量組 1 5.1 3±1.4 0##▲▲△ 1 5.6 3±1.2 4##▲▲△蟲草益腎顆粒高劑量組 1 0.4 8±1.0 5##▲▲△△ 1 3.6 0±1.3 1##▲▲△△組別

2.3 各組細胞p22phox的mRNA表達比較 與正常組比較，相同時點高糖組p22phox mRNA表達水平明顯升高（P＜0.01）；與高糖組比較，各藥物干預組p22phox mRNA表達水平均下降（P＜0.01），其中蟲草益腎顆粒高劑量組和福辛普利組的效果最為明顯。干預48 h后，與福辛普利組比較，蟲草益腎顆粒高劑量組p22phox mRNA表達水平較高，但差異沒有統計學意義（P＞0.05）。干預72 h后，與福辛普利組比較，蟲草益腎顆粒高劑量組p22phox mRNA表達水平低于福辛普利組（P＜0.01），而蟲草益腎顆粒中劑量組差異無統計學意義 （P＞0.05），蟲草益腎顆粒低劑量組p22phox mRNA表達水平高于福辛普利組（P＜0.01）。見表4。

表4 各組細胞p22phox的mRNA表達比較Tab.4 Comparison of p22phox mRNA expression in each group （±s，n=3）

表4 各組細胞p22phox的mRNA表達比較Tab.4 Comparison of p22phox mRNA expression in each group （±s，n=3）

注：與正常組同時點比較，##P＜0.01；與高糖組同時點比較，▲▲P＜0.01；與福辛普利組同時點比較，△△P＜0.01。Note:Compared with normal group at the same time， ##P＜0.01;compared with high glucose group at the same time， ▲▲P＜0.01;compared with Fosinopril group at the same time， △△P＜0.01.

p 2 2 p h o x m R N A 4 8 h 7 2 h正常組 1.0 1 9±0.0 3 6 1.0 1 3±0.0 2 5高糖組 1.7 7 1±0.0 5 5## 2.1 4 7±0.0 6 1##福辛普利組 1.3 0 9±0.0 9 3##▲▲ 1.6 1 2±0.0 1 5##▲▲蟲草益腎顆粒低劑量組 1.5 6 2±0.0 4 3##▲▲△△ 1.7 2 2±0.0 3 2##▲▲△△蟲草益腎顆粒中劑量組 1.4 7 7±0.0 5 1##▲▲△△ 1.6 2 6±0.0 3 0##▲▲蟲草益腎顆粒高劑量組 1.3 4 7±0.0 7 5##▲▲ 1.5 2 2±0.0 2 4##▲▲△△組別

2.4 各組細胞p22phox的蛋白表達比較 與正常組比較，相同時點高糖組p22phox蛋白表達水平升高（P＜0.01）；與高糖組比較，各藥物干預組蛋白表達下降（P＜0.01）。與福辛普利組比較，干預48 h后，蟲草益腎顆粒低、中、高劑量組p22phox蛋白表達均升高（P＜0.01，P＜0.05）；干預72 h后，蟲草益腎顆粒高劑量組p22phox蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05），而蟲草益腎顆粒低、中劑量組蛋白表達高于福辛普利組（P＜0.01）。 見表5。

表5 各組細胞p22phox的蛋白表達比較Tab.5 Comparison of p22phox protein expression in each group （±s，n=3）

表5 各組細胞p22phox的蛋白表達比較Tab.5 Comparison of p22phox protein expression in each group （±s，n=3）

注：與正常組同時點比較，##P＜0.01；與高糖組同時點比較，▲▲P＜0.01；與福辛普利組同時點比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。Note:Compared with normal group at the same time， ##P＜0.01;compared with high glucose group at the same time， ▲▲P＜0.01;compared with Fosinopril group at the same time， △P＜0.05， △△P＜0.01.

p 2 2 p h o x蛋白4 8 h 7 2 h正常組 0.1 0 0±0.0 0 2 0.2 6 4±0.0 0 6高糖組 1.0 0 5±0.0 4 7## 1.0 0 1±0.0 4 9##福辛普利組 0.2 2 3±0.0 3 8##▲▲ 0.4 3 2±0.0 1 5##▲▲蟲草益腎顆粒低劑量組 0.4 6 6±0.0 3 5##▲▲△△ 0.7 9 9±0.0 1 9##▲▲△△蟲草益腎顆粒中劑量組 0.4 6 4±0.0 3 2##▲▲△△ 0.6 9 2±0.0 2 7##▲▲△△蟲草益腎顆粒高劑量組 0.2 9 7±0.0 2 7##▲▲△ 0.4 6 6±0.0 1 7##▲▲組別

3 討論

DKD在中國古代醫籍中沒有相同病名的記載，但是與DKD癥狀類似的病癥記載卻并不少，如古代醫籍中關于“腎消”或“消腎”的論述就與DKD的癥狀相類似。當然，這些論述只是與DKD某個階段的癥狀相似，DKD發展到中后期，會出現水腫、少尿以及貧血等多種癥狀，又與古代醫籍中的“水腫”“淋證”“虛勞”等相似。現代中醫認為，該病病機為腎虛，腎虛影響三焦氣化而產生瘀血、痰濕以及濁毒等病理產物，這些病理產物互為表里，相互影響，導致病情遷延難愈[13-14]。本研究團隊認為，DKD的病機多為本虛標實，以脾腎虧虛為本，以痰瘀互結為標，三焦氣機壅滯不通，氣化功能失常，引起臟腑升降失司而致病，故治療上應注意調暢氣機，通利三焦[15]。宋立群教授以健脾益腎、祛瘀泄濁為DKD的治療大法，在治療上選用經驗方蟲草益腎顆粒（發酵蟲草菌絲粉、生黃芪、貓須草、制大黃、水蛭）。方中重用蟲草為君，補肺益腎；生黃芪、制大黃為臣，補脾活血泄濁；貓須草（別名腎茶）、水蛭為佐使，利濕破血逐瘀、芳化濕濁，全方溫、清、補、消并用，共奏養護正氣、祛痰逐瘀、推陳致新之功，對于DKD正虛不足、痰瘀互結、久病失養者頗為適宜。

在本研究中，以24 h為間隔，對72 h內高糖環境下的HMCs增殖情況進行觀察，發現72 h內高糖環境下的HMCs增殖特點為雙相過程，同時也證實此次研究選擇的時點（48、72 h）具有實驗意義；同一藥物濃度下，不同作用時點的HMCs增殖速度具有明顯差異。干預72 h后，蟲草益腎顆粒對HMCs增殖的抑制作用更為明顯，療效更好，說明蟲草益腎顆粒療效存在時間依賴性；在同一時間點，隨著藥物濃度增加，HMCs增殖速度逐漸下降，說明蟲草益腎顆粒療效存在藥物濃度依賴性。

在正常的人體中，抗氧化系統會通過抗氧化反應來清除體內的ROS，從而使細胞的氧化還原反應保持在一個動態平衡的狀態[16]。但是，當氧化應激反應過度時，人體組織細胞就會出現氧化損傷，進而導致細胞凋亡，并進一步損傷腎臟，引起DKD[17-19]。在腎臟中，ROS的生成與NADPH氧化酶有直接關系[20]，NADPH氧化酶是一個由細胞膜結合色素b558、細胞胞質調節蛋白以及小分子三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）結合蛋白構成的酶復合體，其中細胞膜結合色素b558，主要是由p22phox和gp91phox/NADPH氧化酶2構成，腎臟中ROS便是由表達于HMCs的p22phox產生的[21-23]，因此本研究通過檢測p22phox表達情況，以及由p22phox產生的ROS水平，從基因和蛋白水平兩個角度來分析蟲草益腎顆粒對機體過度氧化應激反應的抑制效果。結果表明，高糖環境下HMCs的ROS水平明顯上升，說明HMCs處于高氧化應激狀態。藥物干預之后，各藥物干預組HMCs的ROS水平均明顯下降，干預48 h后，僅蟲草益腎顆粒高劑量組的療效優于福辛普利組，干預72 h后，蟲草益腎顆粒中、高劑量組的療效均優于福辛普利組，由此可見，蟲草益腎顆粒對于抑制ROS生成的效果存在時間-效應依賴關系。在同一時間點，蟲草益腎顆粒高劑量組抑制p22phox表達情況明顯優于低、中劑量組，提示蟲草益腎顆粒存在劑量效應關系。隨著干預時間的延長，干預72 h時蟲草益腎顆粒抑制p22phox基因表達的作用強于福辛普利組。通過以上結果可以看出，蟲草益腎顆粒抑制p22phox基因表達具有時間效應關系。對于p22phox蛋白表達，干預48 h后蟲草益腎顆粒高劑量組抑制p22phox蛋白表達的作用弱于福辛普利組；干預72 h后，兩者對p22phox蛋白表達抑制效果持平，分析認為蟲草益腎顆粒抑制p22phox蛋白表達的能力弱于福辛普利組，其原因可能與其更長的半衰期有關。從以上結果可以看出，蟲草益腎顆粒在抑制ROS生成方面雖然優于福辛普利組，但是在抑制p22phox基因表達和蛋白表達方面則沒有明顯的優勢，這可能是因為蟲草益腎顆粒在抑制ROS生成方面有其他信號通路參與。

綜上所述，本研究提示蟲草益腎顆粒可能通過抑制p22phox基因轉錄，下調p22phox蛋白表達，來減少細胞內ROS的生成，從而減輕氧化應激反應，延緩DKD的發生發展。