miR-138靶向調控FAK抑制三陰型乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲轉移的機制

王棧山，譚 勝，駱廣濤，王本忠

三陰型乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)是指ER、PR、HER-2均陰性的乳腺癌亞型[1]。MicroRNA(miRNA)是一類廣泛存在于真核生物中，由19～24個核苷酸組成的內源性非編碼RNA[2-3]。已往研究表明，miR-138在肺癌、結腸癌和乳腺癌等多種惡性腫瘤中表達下調，提示miR-138作為抑癌基因可能為腫瘤治療提供新的靶點[4-6]。然而，目前關于miR-138在TNBC中的生物學功能及其下游調控機制研究較少。本研究擬選取人TNBC細胞株MDA-MB-231作為研究對象，初步探討miR-138在TNBC侵襲、轉移中的作用，并通過生物信息學以及分子生物學實驗探討miR-138的下游靶基因及其具體調控機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要實驗試劑MDA-MB-231細胞株由本課題組長期保存，細胞株來源于美國模式培養物集存庫(American Type Culture Collection, ATCC)。DMEM培養基購于Hyclone公司，胎牛血清(FBS)購于Gibco公司；Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于Promega公司；Trizol購于Invitrogen公司；Transwell小室購于Corning公司，Matrigel膠購于BD公司；Real-time PCR試劑盒購于ABI公司；DNA小抽及中抽試劑盒購于Axygen公司；miR-138 mimics、miR-138 mimics NC、miR-138 Inhibitor、miR-138 Inhibitor NC、FAK siRNA及FAK siRNA NC購于銳博公司；Western blot蛋白Marker購于Thermo Scientific公司；β-Actin抗體購于Abcam公司；FAK抗體、兔二抗和鼠二抗購于CST公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 將MDA-MB-231細胞置于含10%FBS的DMEM培養基，37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養，根據細胞狀態2～3日傳代1次。

1.2.2Real-time PCR 首先運用Trizol法抽提細胞總RNA，采用逆轉錄試劑盒反轉為cDNA。Real-time PCR使用SYBR Green PCR Master Mixture檢測MDA-MB-231細胞中miR-138的相對表達量，用U6作為內參，每個樣品設置3個復孔。miR-138引物序列：正向5′-GCCGCAGCTGGTGTTGTGAATCA-3′，反向5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6引物序列：正向5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。Real-time PCR 反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，合計40個循環。溶解曲線條件：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。通過2-ΔΔCt法計算樣品miR-138的相對表達量。

1.2.3Transwell細胞遷移和侵襲實驗 非Matrigel膠覆蓋和Matrigel膠覆蓋的Transwell實驗分別檢測MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲能力。MDA-MB-231細胞消化、離心并棄去培養基，使用不含血清的培養基重懸，調整細胞密度至4×108/L。下室加入600 μL含10%FBS的完全培養基，24～48 h后棄去下室培養基，90%乙醇室溫固定30 min。晾干后使用0.1%結晶紫染色15 min。用潔凈棉簽擦掉上室未穿過孔膜的細胞，顯微鏡下拍照并計數。Transwell遷移實驗無需鋪Matrigel膠，其余實驗步驟與侵襲實驗一致。

1.2.4miR-138下游靶基因預測 通過TargetScan、PicTar和miRanda三個miRNA靶基因在線預測工具共同預測miR-138的下游靶基因。使用這三種預測工具得到miR-138下游靶基因列表后，繪制Venn圖，取列表交集并通過文獻檢索等方法篩選miR-138的下游靶基因。

1.2.5Western blot 使用Western blot技術檢測FAK蛋白表達，內參蛋白為β-Actin。首先進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%。用移液槍將蛋白樣品緩慢加入到膠孔內。設置起始電壓為100 V，待蛋白樣品在濃縮膠壓縮呈一條直線后，改電壓為150 V。電泳終止后，卸下膠板并組裝“三明治”轉膜裝置開始轉膜。轉膜結束后使用5%脫脂牛奶常溫搖床封閉1 h。封閉結束用TBS洗滌1次，4 ℃搖床用一抗(FAK 1 ∶1 000，β-Actin 1 ∶2 000)孵育過夜。第2天回收一抗，TBS洗10 min，共3次。常溫搖床用二抗(1 ∶5 000)孵育1 h，TBS洗10 min，共3次。顯影并保存曝光結果。

1.2.6雙熒光素酶報告實驗 在NCBI下載人FAK基因序列，設計PCR引物并擴增FAK 3’UTR。將FAK 3’UTR序列插入到psiCHECK2質粒構建psiCHECK2-FAK 3’UTR(野生型)。同時將FAK 3’UTR上miR-138相應識別位點突變后插入到psiCHECK2質粒中構建突變質粒psiCHECK2-MUT-FAK 3’UTR(突變型)。構建的FAK 3’UTR野生型質?；蛲蛔冃唾|粒在MDA-MB-231細胞分別與miR-138 mimics或miR-138 mimics NC共轉染。實驗具體分組見表1。共轉染24 h后收集細胞并加入細胞裂解液，置于搖床避光低速孵育20 min。將細胞裂解液轉移至新的離心管，置于冰上。檢測各轉染組的熒光素酶活性值。實驗重復3次。

表1 雙熒光素酶報告實驗分組

1.2.7實驗分組 miR-138過表達實驗分組：MDA-MB-231細胞分別轉染miR-138 mimics(miR-138組)及其陰性對照miR-138 mimics NC(NC組)。miR-138功能回復實驗進行回復實驗Ⅰ及回復實驗Ⅱ，具體分組如表2所示。

表2 miR-138功能回復實驗分組

2 結果

2.1 過表達miR-138后MDA-MB-231細胞遷移及侵襲能力的改變為驗證miR-138 mimics的過表達效率，本組應用Real-time PCR檢測MDA-MB-231細胞分別轉染miR-138 mimics及miR-138 mimics NC后miR-138的相對表達量，結果顯示：與NC組相比，miR-138組miR-138的表達量上調了約30倍(P<0.01，圖1)。

圖1 MDA-MB-231細胞轉染miR-138 mimics及陰性對照后miR-138表達變化

Transwell實驗結果顯示：與NC組相比，miR-138組MDA-MB-231細胞的遷移能力降低(P<0.01，圖2)；此外，miR-138組細胞侵襲能力亦較NC組降低(P<0.01，圖2)。上述結果表明過表達miR-138可抑制MDA-MB-231細胞的侵襲和轉移能力。

圖2 Transwell遷移和侵襲實驗檢測MDA-MB-231細胞轉染miR-138 mimics及陰性對照后遷移和侵襲能力的改變

2.2 生物信息學預測miR-138下游靶基因使用TargetScan、PicTar和miRanda三種在線預測工具得到miR-138下游靶基因列表，繪制Venn圖，取列表交集發現有58個基因在三種預測工具中均是miR-138的靶基因(圖3A)。進一步分析發現這58個靶基因中FAK基因3’UTR存在miR-138的結合位點，且該結合位點在包括智人、黑猩猩等多個物種中高度保守(圖3B、C)。綜上生物信息學結果表明：FAK可能是miR-138的下游靶基因。

圖3 生物信息學預測miR-138的下游靶基因：A.TargetScan、PicTar和miRanda預測miR-138下游基因的Venn圖；B.FAK 3’UTR上miR-138的識別位點位于其3’UTR的56～63處，在智人(H.Sapiens)、黑猩猩(P.Troglodytes)、恒河猴(M. mulatta)、家鼠(M. musculus)及褐鼠(R. norvegicus)等物種中高度保守；C. FAK 3’UTR上miR-138的識別位點及FAK 3’UTR的突變位點

2.3 驗證miR-138與下游靶基因FAK的靶向關系本組構建psiCHECK2-FAK 3’UTR(野生型)及psiCHECK2-MUT-FAK 3’UTR(突變型)質粒，突變位點見圖3C。使用雙熒光素酶報告實驗和Western blot驗證miR-138與FAK基因的靶向關系。雙熒光素酶報告實驗結果顯示：與野生型對照組相比，野生型處理組熒光素酶活性顯著降低(P<0.01，圖4A)；突變型處理組熒光素酶活性較突變型對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)。Western blot結果顯示：與陰性對照組相比，miR-138 mimics組FAK蛋白表達量顯著降低(圖4B)。上述結果證實FAK是miR-138的下游靶基因。

圖4 雙熒光素酶報告實驗和Western blot驗證miR-138與FAK基因的靶向關系：A.雙熒光素酶報告實驗檢測miR-138結合FAK 3’UTR熒光素酶活性：WT 3’UTR. psiCHECK2-FAK 3’UTR(野生型)；MUT 3’UTR. psiCHECK2-MUT-FAK 3’UTR(突變型)；B.Western blot檢測過表達miR-138后FAK蛋白表達變化

2.4 miR-138通過調控FAK表達抑制乳腺癌轉移回復實驗Ⅰ結果顯示：與對照組相比，miR-138處理組FAK蛋白表達量下調(圖5A)；與miR-138處理組相比，回復組FAK蛋白表達量上調(圖5A)。Transwell細胞遷移與侵襲實驗結果顯示：與對照組相比，miR-138處理組細胞的遷移與侵襲能力均降低(P<0.01，圖5B、C)；與miR-138處理組相比，回復組細胞的遷移與侵襲能力均增強(P<0.01，圖5B、C)。上述結果表明上調FAK可以部分恢復miR-138過表達所抑制的細胞遷移與侵襲能力。

圖5 上調FAK對miR-138過表達所抑制的細胞遷移與侵襲能力的影響(回復實驗Ⅰ)：A.Western blot檢測MDA-MB-231細胞各轉染組FAK蛋白表達改變；B.Transwell細胞遷移實驗檢測MDA-MB-231細胞各轉染組的遷移細胞數；C.Transwell細胞侵襲實驗檢測MDA-MB-231細胞各轉染組的侵襲細胞數；對照組：miR-138 mimics NC+Vec共轉染組(NC+Vec)；miR-138處理組：miR-138 mimics+Vec共轉染組(miR-138+Vec)；回復組：miR-138 mimics+FAK共轉染組(miR-138+FAK)

回復實驗Ⅱ結果顯示：與對照組相比，miR-138處理組FAK蛋白表達量上調(圖6A)；與miR-138處理組相比，回復組FAK蛋白表達量下調(圖6A)。Transwell細胞遷移與侵襲實驗結果顯示：與對照組相比，miR-138處理組細胞的遷移與侵襲能力均顯著增強(P<0.05，圖6B、C)；與miR-138處理組相比，回復組細胞的遷移與侵襲能力均顯著降低(P<0.05，圖6B、C)。上述結果表明，使用FAK siRNA敲低FAK可以部分回復miR-138抑制所增強的細胞遷移與侵襲能力。

圖6 敲低FAK對miR-138抑制所增強的細胞遷移與侵襲能力的影響(回復實驗Ⅱ)：A.Western blot檢測MDA-MB-231細胞各轉染組FAK蛋白表達改變；B.Transwell細胞遷移實驗檢測MDA-MB-231細胞各轉染組發生遷移的細胞數目；C.Transwell細胞侵襲實驗檢測MDA-MB-231細胞各轉染組發生侵襲的細胞數目；對照組：miR-138 Inhibitor NC+FAK siRNA NC共轉染組(Inhibitor NC+siNC)；miR-138處理組：miR-138 Inhibitor+FAK siRNA NC共轉染組(miR-138 In+siNC)；回復組：miR-138 Inhibitor+FAK siRNA共轉染組(miR-138 In+siFAK)

3 討論

目前,乳腺癌是全球女性發病率最高的惡性腫瘤[7]。近年來乳腺癌發病率逐年上升，根據最新研究統計，乳腺癌每年新發病例約占所有女性新發腫瘤的25%[8]。TNBC作為乳腺癌惡性程度最高的分子亞型，對內分泌治療及靶向治療均不敏感，具有侵襲性強，早期易復發、轉移等特點，臨床治療預后極差。有研究表明伴復發轉移的TNBC患者總體生存期(overall survival, OS)僅為13～18個月[9]。深入探究TNBC的侵襲轉移機制，尋找新的治療靶點，可為TNBC患者治療策略的選擇和預后判斷提供新思路。

多種惡性腫瘤的miRNA表達譜發生特征性改變，導致其調控的基因網絡異常，從而賦予腫瘤細胞諸如無限增殖、凋亡抵抗、侵襲轉移及放化療抵抗等惡性表型。有研究表明miR-138在多種腫瘤組織中表達下調[10]。此前，本課題組檢測了14例正常乳腺組織和21例乳腺癌組織中miR-138的表達情況，結果顯示：相較于正常乳腺組織，乳腺癌組織中miR-138表達量顯著下調(本文未顯示相關數據)。為探討miR-138對TNBC侵襲、轉移功能的影響，本課題組選擇了高轉移潛能的TNBC細胞株MDA-MB-231開展本實驗，過表達miR-138后，MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲能力均顯著降低，表明miR-138可能在TNBC中發揮抑癌基因作用，這與既往報道的miR-138在腫瘤中的功能相一致[4-6]。

FAK是一種非受體酪氨酸激酶，在結直腸癌、前列腺癌及乳腺癌等多種腫瘤組織中高表達[11]。此前研究表明，FAK可通過PI3K/Akt信號通路調控腫瘤細胞黏附、遷移及侵襲等生物學行為，是腫瘤惡性進展的重要調控因子[11]。此外，FAK還參與整合素依賴性信號通路，介導胞內多條信號通路的串擾反應(crosstalk)，進而調控腫瘤的侵襲、轉移[11]。TargetScan、PicTar和miRanda三種在線預測工具均預測FAK可能是miR-138潛在的靶標基因。本實驗挑選FAK作為下一步的研究基因是因為：(1)FAK在乳腺癌等多種惡性腫瘤中表達升高[11]；(2)FAK與乳腺癌侵襲、轉移密切相關[12]；(3)包括miR-1224在內的若干miRNAs能調控FAK表達抑制腫瘤的侵襲、轉移[13]。本課題組采用雙熒光素酶報告實驗和Western blot法證實FAK是miR-138的下游靶基因，并進一步通過回復實驗證實，在TNBC細胞中miR-138通過調控FAK發揮其生物學功能。

越來越多的研究表明：FAK可通過調控特定靶點及相關信號通路“馴化”腫瘤微環境的免疫細胞，促進腫瘤的惡性進展[14-16]。Rath等[15]發現FAK上調是導致胰腺癌纖維化和免疫耐受微環境形成的重要原因。Serrels等[16]證實FAK可以通過調節TGF-β和CCL5的表達量，增加腫瘤微環境調節性T細胞的數量，從而抑制CD8+T細胞的殺傷力。近期一項研究表明：FAK通過調控外泌體miRNAs表達譜，在乳腺癌轉移中扮演著重要角色[17]。外泌體是由腫瘤細胞、上皮細胞及T細胞等多種細胞在胞吞過程中產生的直徑30～150 nm的膜性囊泡[18-19]，是參與腫瘤發生、發展及轉移的重要介質。本組前期研究發現，低氧腫瘤細胞分泌的外泌體誘導巨噬細胞發生M2型極化，極化后的巨噬細胞通過分泌TGF-β、IL-10等促進腫瘤的侵襲、轉移[20]。外泌體作為體內跨越不同生物屏障進行藥物傳遞的有效工具，除作為化療藥物理想的載體外，對siRNA及miRNA等人工合成的核酸類物質也有非常好的傳遞作用。理論上，通過外泌體外源性導入miR-138能通過調控其下游靶基因FAK抑制腫瘤的侵襲、轉移。截至目前，人們對外泌體miRNAs及FAK在腫瘤微環境中的作用機制以及相關信號通路方面的研究尚淺?，F階段外泌體釋放、靶向運輸機制尚未完全闡明，外泌體的人工修飾技術亦未完全成熟。倘若在未來能夠攻克這些外泌體的理論和技術難題，通過外泌體導入miR-138可能會成為一種新的TNBC靶向治療方案。

本實驗結果表明，miR-138通過靶向調控FAK抑制TNBC的侵襲、轉移。本研究僅初步探討了miR-138在TNBC中的功能，仍有諸多難題亟待解決。如miR-138對體內腫瘤轉移能力的影響如何，miR-138在TNBC細胞是否存在其他下游靶基因，miR-138在TNBC分泌的外泌體中表達是否存在差異以及差異表達的外泌體miR-138是否影響TNBC的侵襲、轉移，高選擇性FAK抑制劑如CT-707[21]、VS-6063[22]及BI 853520[23]等是否能抑制TNBC的惡性進展。本課題組將對以上問題開展后續實驗以探明內在關系。