宏基因組二代測序技術輔助診斷新生兒埃可病毒18型聚集性感染

尚永朋，趙宇曦，鄧名貴，歐陽莉麗，彭壬海，李佩玉，余治健，鄧啟文

(1. 深圳大學醫學部生物醫學工程學院 廣東省生物醫學信息檢測與超聲成像重點實驗室，廣東 深圳 518052；2. 華中科技大學協和深圳醫院 深圳大學醫學部第六附屬醫院感染科，廣東 深圳 518052)

埃可病毒屬于人類腸道病毒B型，主要經糞-口途徑傳播，多為無癥狀感染，但由于新生兒的免疫系統尚未發育成熟，其感染埃可病毒發生腦膜炎的風險高，病死率高[1]。近年來，國內兒科及新生兒埃可病毒聚集性感染事件頻發，對該病毒快速、準確的檢測顯得尤為重要[2-11]。埃可病毒病原學檢測方法包括：病毒分離、血清抗體檢測和逆轉錄聚合酶鏈反應(PCR)檢測RNA，其中病毒分離檢測對設備和人員專業技術要求高，檢測周期長，無法作為常規檢測方法；血清抗體以及PCR技術雖然檢測時間較病毒分離時間明顯縮短，但腸道病毒種類和分型較多，治療方式和預后差異較大，因此兩種方法對埃可病毒的診斷意義有限[12]。宏基因組二代測序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)技術可檢測細菌、病毒、真菌和寄生蟲等多種病原體，為臨床上難以培養病原體的診斷提供了有效的技術途徑[13-15]。本研究分析在新生兒未知原因感染中，采用mNGS快速輔助診斷腸道埃可病毒18(Echovirus 18, ECO18)型感染的可行性，以及ECO18型傳染源和感染情況。

1 材料與方法

1.1 標本來源 采集2020年7月9日—8月6日在深圳某三甲醫院新生兒中心新生兒的口咽拭子、糞便拭子和血液標本，醫護人員(包括醫生、護士、護理員和清潔工) 口咽拭子和肛拭子標本，以及該病房浴缸、廁所、床、奶瓶和臉盆的環境標本。本研究為回顧性研究，凡涉及人的標本檢測，均獲得該醫院倫理委員會審核批準并按照標準執行，新生兒標本獲得新生兒監護人知情同意。

1.2 病原學檢測 新生兒的血液、口咽拭子和肛拭子標本由檢驗科常規細菌培養，由華大基因進行mNGS，腸道病毒通用PCR和ECO18型特異性PCR由深圳市南山區疾病預防控制中心完成。腸道病毒通用型引物為5’- CAAGCACTTCTGTTTCCCCGG-3’和5’-ACCCATAGTAGTCGGTTCCGC-3’[16]，ECO18型特異性引物為5’-GGCCCCTGAATGCGGCTAAT-3’和5’-GTTCTGGGATCATTTAA-3’[17]。醫護人員的口咽拭子和肛拭子以及環境標本，由華大基因進行mNGS。

1.3 數據可用性聲明 生物樣本原始數據可以在NCBI生物樣本數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/)中獲得，登記號為SAMN14839103-SAMN14839224。

2 結果

2.1 感染病例調查結果 病例1于2020年7月20日因發熱、腹瀉入該院新生兒中心治療，7月25日采集其血液、口咽和肛拭子標本，由檢驗科常規細菌培養并外送金域檢驗進行腸道病毒檢測，同時隔離治療；檢測結果顯示：所有標本細菌培養陰性，腸道病毒通用PCR陽性，將其轉入隔離病房2，對癥治療后于7月27日治愈出院。7月26—27日病例2、3和6出現輕微腹瀉或發熱，存在醫院感染的風險，逐將病例3轉入隔離病房1接受治療；7月28日病例4和5出現發熱、腹瀉和皮疹癥狀。病例2、4、5和6于7月25—27日住在同一病房中，但其床位分布相對分散。見圖1～2及表1。為防止疫情暴發，7月28日，新生兒科全面關閉，該病房24例新生兒轉移至外院接受隔離治療并跟蹤病情，無發熱、腹瀉和皮疹癥狀直至康復出院。出院后，對發熱的6例新生兒跟蹤隨訪7 d，采用腸道通用病毒PCR檢測新生兒肛拭子標本，結果顯示均為陰性。

表1 6例ECO18型感染新生兒的臨床資料及檢測結果

2.2 病原體鑒定結果 7月29日6例新生兒肛拭子標本腸道通用病毒PCR檢測結果均為陽性，除病例1未檢測外，其他5例新生兒肛拭子病毒特異性PCR檢測結果顯示，輪狀病毒及埃可病毒11型均陰性。為明確病原體并防止醫院感染，將上述6例新生兒的血、口咽拭子和肛拭子標本進行mNGS分析，結果顯示6例病例中，病例1、2、3和5肛拭子標本中檢出ECO18型病原體，病例2、4和6血標本中檢出ECO18型病原體，病例5血標本、口咽拭子和肛拭子中檢出人類皰疹病毒6型(HHV-6)病原體。隨后對6例新生兒的肛拭子進行ECO18型特異性PCR驗證，均為陽性。見表1。不同標本mNGS檢出ECO18型病毒情況見表2。

表2 不同標本mNGS檢出ECO18型病毒情況

2.3 傳播途徑調查結果 為追蹤埃可病毒感染的來源和傳播途徑，監測病毒在該病房人群和環境(奶瓶、洗手盆、水力閥、病床等)中的定植或污染情況。7月27日采集該病房中其他18例無發熱、腹瀉或皮疹癥狀的新生兒和44名醫護人員標本(咽、肛拭子)，以及環境標本，進行腸道病毒通用PCR和mNGS檢測，mNGS結果顯示18例無癥狀新生兒肛拭子標本中有2例(N-17和N-33，見圖2)ECO18型陽性，其余標本均未檢出腸道病毒。

3 討論

埃可病毒是一種常見的腸病毒亞型，免疫功能不全的新生兒對該病毒高度易感。感染ECO18型的新生兒通常無癥狀，但也有一些表現為無菌性腦膜炎、急性弛緩性麻痹、發熱、腹瀉和皮疹[18]。鑒于國內已報告多起由埃可病毒不同型(6、11、18、25型等)引起的醫院感染暴發事件，醫護人員應警惕埃可病毒在新生兒病房的傳播[2-12]。本研究中，新生兒中心6例新生兒感染ECO18型，臨床癥狀輕微，僅表現為發熱、腹瀉或皮疹等，輕癥病例均迅速康復，無后遺癥。但多例病例同時發生輕癥感染應警惕，尤其應避免引起醫院聚集性感染事件的發生。

腸道病毒種類和分型較多，治療方式和預后差異較大，因此快速鑒定未知病原體的種類和分型是臨床急切需要解決的問題[12]。mNGS作為一種輔助臨床快速鑒定病原體的工具，可以檢測傳統方法難以培養或擴增的病原體，近年來多篇報道[15，19-20]表明，利用mNGS方法可以鑒定多種病原體，且能精確分類到種以及分型，其靈敏度和特異度優于傳統培養或PCR方法。本研究中所有病例的肛拭子和血標本通過傳統的細菌培養，無法檢測到病原體，采用腸道病毒通用PCR方法檢測為陽性，提示臨床病例可能為腸道病毒感染，但采用上述兩種方法無法鑒定到具體病原體的種屬。本研究特異性PCR結果為常見腸道病毒輪狀病毒及埃可病毒11均陰性，特異性PCR難以檢測到不常見的腸道病毒種類，有可能誤導臨床醫生排除埃可病毒感染，而采用mNGS方法鑒定出ECO18型。mNGS檢測6例新生兒口咽拭子、血和肛拭子標本，3例新生兒血和4例新生兒的肛拭子均檢出ECO18型，覆蓋了全部6例新生兒，在有明確種類和分型的提示下，對6例病例的肛拭子標本進行ECO18型特異性PCR檢測，結果均為陽性，此過程中mNGS對病原體的確定起到了關鍵的提示作用。另外病例5在血、咽拭子和肛拭子中均檢測到HHV-6，提示可能存在合并感染。上述結果表明，在新生兒未知原因發熱的感染病毒病原體快速鑒定中，mNGS的早期使用具有重要的臨床診斷價值。

因腸道病毒最常見的傳播途徑是糞-口途徑，考慮多例新生兒有共同的管床醫生，可能存在醫務人員手衛生不規范導致的傳播。為追蹤病原體的來源和傳播途徑，采用mNGS和特異性ECO18型PCR方法進一步監測病房中其他新生兒、醫護人員口咽拭子和肛拭子標本，以及奶瓶、洗手盆、水力閥、病床等環境標本，結果顯示均未檢測到ECO18型或其他腸道病毒，提示該病房新生兒的病毒可能并非來自醫護人員或環境，也可能是病毒在環境中數量少、存活時間短，難以檢出。由于無法確定該病房中病毒的來源和傳播途徑，為切斷感染途徑，防止其他新生兒感染，在發現聚集性感染發生的第一時間，執行了以下防控措施：①立即隔離新生兒，專人管理，限制探視；②完善病原學檢查，查找感染病因，繼續新生兒科治療方案；③醫務人員實施標準預防(接觸新生兒及周圍環境和物品，須穿戴一次性帽子、口罩、手套、隔離衣)，嚴格執行無菌操作，規范執行手衛生；④增加病房通風次數，加強環境、設備、新生兒相關物品及空氣等消毒工作，增加物體表面、地面消毒頻次(含有效氯1 000 mg/L消毒劑擦拭2次/d)；⑤新生兒物品專人專用，奶瓶、奶嘴一人一用一消毒，洗浴盆一人一用一消毒；⑥加強醫療廢物管理，所有感染新生兒的生活垃圾及時放入醫療廢物袋，按感染性廢物處理。

與PCR方法相比，mNGS方法存在成本高的缺點，但其具有快速、靈敏以及準確，且可以同時在物種水平和分型上檢出不同病原體的優勢[15]。對于本研究的病原體—埃可病毒，mNGS在肛拭子中檢出率最高(66.67%)，其次為血(50.00%)，口咽拭子檢出率為0，依據任意一種標本陽性則認定為陽性計算檢出率，6例病例使用mNGS檢出率為100%，提示同時采集不同類型的標本，尤其是肛拭子和血，可以提高腸道病毒檢出率。

本研究局限性在于：首先此次新生兒科聚集性感染除病例1為7月20日發熱、腹瀉外，其余5例均在7月25—28日4 d內出現臨床癥狀，具有時間上的高度重合， mNGS檢測結果顯示均為ECO18型感染，因此初步判斷是同一感染源。但由于本研究中的肛拭子和血標本測序獲得的病毒片段數量較少(1～39個reads)，難以拼接成為完整的序列，因此，未進一步進行病毒序列的拼接和比對，無法從序列上驗證病原體的同源性。其次，本探究在發現聚集性感染第一時間，對醫務人員手和環境標本進行采樣和檢測，可能由于RNA病毒在環境中容易降解，因此未檢測到ECO18型及其他腸道病毒，無法確定本研究中病毒的來源和傳播途徑。

雖然大多數新生兒感染埃可病毒是無癥狀感染，但仍有導致腦膜炎，甚至死亡的高風險。因此，在新生兒出現未知原因的發熱或腹瀉時，快速和準確診斷其感染病原體尤其重要。

綜上所述，本研究數據顯示，mNGS可以檢測出ECO18型感染患者血清或糞便中的低拷貝數ECO18型病毒，證明mNGS是一種有效的輔助性診斷腸道病毒感染的方法，并且具有追溯醫院聚集性感染病原體的潛力。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。