HIV-1低病毒載量患者外周血前病毒DNA優勢耐藥位點分析

余維維，陳 鐘，彭 爽，曾紫微，祁 慧，王 通，王 敏

(1. 南華大學附屬長沙醫院傳染科，湖南 長沙 421001； 2. 長沙市第一醫院艾滋病研究所，湖南 長沙 410005)

臨床上用于判斷抗逆轉錄病毒療法(antiretroviral therapy，ART)治療效果的重要方法是檢測血漿病毒載量(viral load, VL)。研究[1]表明4%～10%的人類免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)感染者，在接受ART治療后，仍維持低病毒載量(low viral load, LVL)，HIV-1感染者出現病毒學失敗，產生耐藥性的風險更高。基于Sanger測序的傳統HIV-1 RNA基因耐藥檢測方法通常只能檢測VL≥1 000 copies/mL的HIV-1感染者，當VL<1 000 copies/mL時，病毒基因的擴增失敗率較高，導致部分患者的耐藥情況易被忽視而導致無法及時進行處理，《全國艾滋病檢測技術規范(2015年修訂版)》指出：當耐藥毒株在病毒群體中低于10%～20%時，通常檢測不到其存在[2]。

2018年，加拿大艾滋病診療指南中提出對HIV-1 RNA <1 000 copies/mL的患者，可以進行HIV-1前病毒DNA基因型耐藥檢測[3]。《全國艾滋病檢測技術規范(2020年修訂版)》在全球范圍內首次將HIV-1前病毒DNA定量檢測納入檢測規范中，文中指出：HIV-1前病毒DNA定量檢測可判定HIV儲存庫含量，可更準確預測HIV傳播風險和病程發展[4]。為更科學有效的指導艾滋病防治工作，針對HIV-1 RNA病毒載量在50～1 000 copies/mL的LVL患者，本研究利用Sanger測序方法，對某院2020年5月—2021年5月門診已接受抗病毒治療半年以上、診斷為LVL的HIV-1感染者的HIV-1前病毒 DNA耐藥情況開展研究。HIV-1前病毒DNA在患者個體水平存在高度的變異性，Sanger測序的原理是對所有序列中豐度占比最高的優勢DNA序列(dominant sequence)進行優先測序，這些優勢序列的占比理論上要超過總序列數的40%[5]。HIV-1 DNA水平的耐藥突變(drug-resistance mutations, DRMs)信息，代表HIV-1感染者外周血HIV-1儲存庫中的優勢DRMs。

1 對象與方法

1.1 研究對象 研究納入2020年5月—2021年5月在該院門診接受抗病毒治療6個月以上且連續兩次檢測VL為50～1 000 copies/mL的HIV-1感染者進行分析。入組標準：(1)年齡>18歲，通過艾滋病抗體確證試驗確證的HIV-1感染者；(2)接受抗病毒治療6個月以上；(3)連續兩次檢測VL為50～1 000 copies/mL[6-7]；(4)簽署知情同意書。以上條件應同時滿足。收集符合以上納入標準患者的抗凝全血標本，-80℃冰箱儲存備用。

1.2 主要儀器及試劑 主要儀器：Sanger測序儀、熒光定量PCR儀。主要試劑：人類免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)DNA定量檢測試劑盒(廣州海力特生物科技有限公司)、核酸提取或純化試劑(海力特)。

1.3 方法

1.3.1 HIV-1 VL和HIV-1 DNA載量的測定 羅氏Cobas TaqMan HIV-1 Test Version 2.0全自動分析系統定量檢測HIV-1 RNA VL。為測定HIV-1 DNA載量，首先從全血標本中提取HIV-1 DNA，并通過熒光定量PCR法對每百萬細胞中HIV-1 DNA的拷貝數進行測定[8-9]。

1.3.2 核酸提取及基因擴增 使用核酸提取純化試劑(海力特)提取全血標本中的HIV-1 DNA，通過in-house HIV-1基因型耐藥檢測方法，進行巢式聚合酶鏈式反應擴增HIV-1 PR/RT區基因片段(對應HXB2國際標準參考株位置為2253～3553)和IN區基因片段(對應HXB2國際標準參考株位置為4230～5076)。

1.3.3 產物的提純 PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠純化，純化后的產物通過Sanger測序。

1.3.4 數據分析 獲得序列后，使用美國斯坦福大學HIV db Program 數據庫9.0版本進行耐藥判定，根據數據庫系統將耐藥程度分為敏感(S)、潛在耐藥(P)、低度耐藥(L)、中度耐藥(I)和高度耐藥(H)5個水平，其中后3個水平判定毒株為耐藥毒株。

2 結果

2.1 基本情況 2020年5月—2021年5月該院門診共檢測5 795例抗病毒治療半年以上的HIV-1感染者的VL，其中診斷為LVL的HIV-1感染者527例(占9.09%)，VL>1 000 copies/mL的HIV-1感染者211例(占3.64%)。依據納入標準，共納入26例研究對象，收集抗凝全血標本儲存備用。26例HIV-1 LVL患者基本情況見表1。

表1 26例HIV-1 LVL患者基本情況及優勢DRMs發生情況

2.2 耐藥情況分析 對已知pol區序列的26例患者的LVL標本進行逆轉錄酶、蛋白酶、整合酶區優勢DRMs分析，病毒型別CRF01_AE發生率最高，為53.84%(14例)，并且在蛋白酶、逆轉錄酶、整合酶區基因位點，均發生了優勢DRMs。CRF07_BC、CRF55_01B、B+C、CRF67_01B、CRF08_BC、B的發生率分別為19.23%(5例)、7.69%(2例)、7.69%(2例)、3.85%(1例)、3.85%(1例)、3.85%(1例)。26例患者的LVL標本中確定7例攜帶優勢DRMs。其中1例攜核苷類逆轉錄酶抑制劑(nucleoside reverse transcriptase inhibitors, NRTIs)優勢DRMs，發生率為3.85%(1例)，4例攜非核苷類逆轉錄酶抑制劑(non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors, NNRTIs)優勢DRMs，發生率為15.38%。蛋白酶抑制劑(protease inhibitors, PIs)優勢DRMs與整合酶抑制劑(integrase inhibitors, INSTIs)優勢DRMs各攜1例，發生率均為3.85%。2號標本的病毒類型為B病毒亞型，其發生了多處優勢DRMs。見表2。

表2 26例患者的HIV-1前病毒DNA 優勢DRMs結果

2.3 耐藥突變標本耐藥程度及抗病毒治療情況 7例出現優勢DRMs的患者標本中，3例出現低中度耐藥，2號標本對多拉韋林(DOR)、依非韋倫(EFV)、依曲韋林(ETR)的耐藥程度為L，對奈韋拉平(NVP)、利匹韋林(RPV)的耐藥程度為I。12號標本對阿巴卡韋(ABC)、替諾福韋(TDF)的耐藥程度為L，13號標本對卡博特韋(CAB)、埃替拉韋(EVG)、拉替拉韋(RAL)的耐藥程度為L。余4例的耐藥程度均為P。2號標本中，目前使用的抗病毒方案為拉米夫定(3TC)+TDF+EFV，而其發生的優勢DRMs對EFV的耐藥程度為L，考慮為主要位點突變。余6例的優勢DRMs考慮為次要位點突變，其對目前的抗病毒治療方案可能無明顯影響。在NNRTI區中V106L的優勢DRMs發生率最高，為7.69%(2例)。NRTI區、PI區、INSTI區優勢DRMs分別為K70KT、M46MI、H51Y，發生率均為3.85%(1例)。見表3。

表3 7例耐藥突變患者的耐藥程度及治療情況

續表3 (Table 3， Continued)

3 討論

HIV-1病毒在感染人體后，病毒進入免疫細胞，脫外殼，RNA逆轉錄成DNA后進入細胞核，大多數HIV-1 DNA整合在人基因組上，形成穩定的病毒儲存庫(HIV-1 DNA)。HIV-1 DNA作為復制模板，轉錄子代RNA，翻譯蛋白并包裝成子代病毒。在病毒感染發生發展的過程中，病毒基因組的各種變化被持續記錄在HIV-1前病毒DNA中，基因突變持續不斷的進入潛伏病毒庫。相較于HIV-1 RNA，HIV-1前病毒DNA具有更大的遺傳異質性，可攜帶大量DRMs[10]。由于RNA耐藥檢測通常在VL>1 000 copies/mL才能實現擴增，因此對于HIV-1 LVL感染者的耐藥檢測研究不多，一般認為其出現病毒學失敗以及耐藥性可能與測序時無法有效攝取患者RNA中的DRMs以及未能及時更換抗病毒治療方案有關[11-13]。

近年來，許多實驗室開發了對低水平病毒復制有效的基因型耐藥性分析的方法。在LVL的HIV-1感染者中，由于研究對象及目的不同，報道的DRMs發生率差異也較大，總體發生率約為49%～72%，在一些研究中也探討了在低水平病毒復制時發生新的DRMs的可能性，結果證明會出現 7%～46%新的DRMs[12.14-15]。在本研究中HIV-1病毒耐藥基因PCR模板來源于全血中的HIV-1前病毒DNA，所采用的Sanger測序策略通過優先測序總序列中豐度占比最高的優勢DNA序列，這些優勢序列的占比理論上要超過總序列數的40%，更加傾向于檢測優勢DRMs，HIV-1 DNA水平的耐藥突變信息，代表HIV-1感染者外周血HIV-1儲存庫中的優勢DRMs。而本研究表明HIV-1前病毒DNA使用Sanger測序可在HIV-1 LVL患者外周血中發現優勢DRMs，可為臨床治療方案的及時調整提供重要的參考信息。但是，該策略是否可有效逆轉或避免治療失敗還需要更進一步的研究加以驗證。目前有相關研究[16-19]表明HIV-1前病毒DNA與血漿游離RNA之間DRMs具有相關性，有研究[20]也初步闡述了其臨床價值，在HIV-1前病毒DNA基因測序指導下更換ART方案不會導致病毒學失敗，可能有助于增加長期安全性和改善生活質量。

DRMs的累積可能通過以下4個階段[21]：①HIV DNA堿基出現DRMs；②HIV DNA的DRMs被復制擴增，開始出現耐藥病毒；③隨著DRMs積累及耐藥病毒復制，可能出現LVL；④耐藥病毒快速增加，臨床表現為病毒反彈或治療失敗。盡管患者體內血漿HIV-1 RNA更能直接反映患者耐藥情況，但HIV-1前病毒DNA也可以在一定程度上反映患者耐藥情況，并且能將耐藥發現的時間點提前，做到在第三階段甚至第二階段就能發現DRMs。

在本研究中，LVL的HIV-1感染者通過HIV-1前病毒DNA擴增的優勢DRMs突變率較高，為26.92%。其中NNRTI攜4例優勢DRMs，NNRTI出現頻數最高的基因突變位點V106L，該位點主要出現在未經治療的HIV感染者的1%～2%的病毒中。若與其他突變位點相結合，將協同降低NNRTI敏感性。NNRTI在資源有限的情況中作為臨床一線用藥，具有較高的DRMs發生率[22]。PI的基因突變位點為M46MI，M46MI是相對非多態性的PI選擇性突變，與降低除達蘆那韋(darunavir，DRV)外的其他PI的敏感性有關。本研究中INSTIs出現1例優勢DRMs，突變位點為H51Y，H51Y 是一種罕見的非多態性附加突變，在接受 RAL 和EVG 的患者中，H51Y最低限度地降低了EVG 和可能的CAB 敏感性。在我國，INSTIs耐藥發生率較低，云南省艾滋病關愛中心鄧雪媚等[23]收集了2015—2016年云南省14個地州(市)未接受過含INSTIs ART的531例HIV-1感染者的血漿，發現29例IN區基因突變的序列標本，9例表現出耐藥，原發性INSTIs耐藥率為1.7%。本研究中還出現了包含V106L、M230MI多耐藥基因位點突變，是唯一1例出現中度耐藥的標本，通常單個突變或僅對一種藥物耐藥的位點單獨出現時耐藥程度并不高，突變的累積增加了耐藥程度，可導致嚴重的交叉耐藥。

綜上所述，本研究通過HIV-1前病毒DNA擴增對LVL的HIV-1感染者的PR/RT區基因片段以及IN區基因片段的序列進行分析，發現了使用HIV-1RNA耐藥檢測方法檢測不到的優勢DRMs，但本研究存在一定局限性，首先，標本量較小，可能會造成耐藥結果的誤差，使耐藥率偏高。其次，本研究未對患者進行基線基因耐藥突變檢測，本次檢測均為ART后，不排除耐藥出現也可能為傳播性耐藥(transmissible drug resistance, TDR)。在HIV-1前病毒DNA上檢測到的優勢DRMs也可能是無法復制的缺陷病毒的一部分，僅僅根據HIV-1前病毒DNA中發現的突變來更換抗病毒治療方案還有待商榷，需要更多標本量，以及提高研究精度，爭取在LVL的HIV-1 RNA水平進行平行對照研究，從而為臨床抉擇提供科學依據。但對于存在優勢DRMs的HIV-1 LVL感染者，有必要增加檢測頻率，以便盡早發現HIV-1感染者出現病毒學失敗[24]，為臨床ART方案的制訂和調整提供有效的參考意見。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。