重組人干擾素α1b通過調控Foxp3對兒童傳染性單核細胞增多癥免疫功能的影響

祁衛衛，楊 寧，路 娟，夏 紅，韓艷珺

(邢臺市人民醫院兒科，河北 邢臺 054000)

傳染性單核細胞增多癥(infectious mononucleo-sis, IM)是兒童常見的原發性EB病毒(EBV)感染疾病，發病的高峰年齡為4～6歲，患兒具有典型的臨床“三聯征”，即發熱、咽峽炎和頸淋巴結腫大[1]。目前，臨床對于兒童IM尚無特效治療方法，一般以抗病毒治療等對癥處理為主。更昔洛韋是一種核苷類抗病毒藥物，是當前兒童IM抗病毒治療的常用藥[2]。既往研究[3]表明，兒童IM的發生發展與機體細胞免疫和體液免疫功能失調密切相關。叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子3(Foxp3)是CD4+CD25+調節性T細胞(CD4+CD25+Treg)的特異性轉錄因子，可通過直接調控多種基因來調節機體免疫應答[4]。重組人干擾素α1b(rhIFN-α1b)是我國第一個國際獨創的基因工程新藥，具有廣譜抗病毒和免疫調節雙重作用，以及高度安全性等特點，近年來已廣泛應用于兒童IM的臨床治療[5]。本研究以2019年3月—2020年3月某院兒科收治的IM患兒為研究對象，觀察rhIFN-α1b治療前后患兒外周血單個核細胞(PBMC)中Foxp3信使核糖核酸(Foxp3 mRNA)表達水平、機體免疫功能及血清相關細胞因子水平的變化，探討其作用機制，并與更昔洛韋常規治療患兒比較，評價rhIFN-α1b在兒童IM治療中的應用效果，現報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2019年3月—2020年3月某院兒科收治的98例IM患兒，使用簡單隨機數字表法將其隨機分成干擾素組(n=49)和更昔洛韋組(n=49)。該研究經該院醫學倫理委員會批準。

1.2 納入與排除標準 納入標準：(1)滿足IM診斷標準，年齡<14歲；(2)未合并心包炎、腦膜炎、脾破裂等嚴重并發癥；(3)患兒法定監護人簽署知情同意書；(4)入院前無抗病毒、免疫調節劑等相關藥物治療史。排除標準：(1)確診為巨細胞病毒、弓形蟲、人免疫缺陷病毒等其他因素所致的類IM者；(2)對rhIFN-α1b、更昔洛韋等本研究涉及藥物中任何成分過敏者；(3)患有免疫缺陷病者；(4)有長期服用免疫抑制劑或糖皮質激素史者；(5)患兒和/或其家屬依從性較差，無法配合本臨床試驗者；(6)合并重要臟器器質性疾病者。

1.3 診斷標準 IM診斷標準參照《諸福棠實用兒科學(第8版)》標準執行[6]，病程處于急性期。

1.4 治療方法 所有患兒均采取相同的一般治療(包括充分臥床休息、防治脾破裂和營養支持治療)及對癥治療(肝功能異常者給予護肝降酶治療，合并細菌感染者予以敏感抗菌藥物治療，心肌酶譜異常者加用心肌營養藥治療，退熱、鎮靜和對高熱患兒酌情補液)。在此基礎上，干擾素組給予注射用rhIFN-α1b(深圳科興生物，規格10 μg/支，產品批號190106)霧化吸入治療，每次將2 μg/kg加入2 mL等滲生理鹽水中均勻混合，氧氣驅動霧化吸入，治療時間15 min/次，2次/d，療程7 d。更昔洛韋組予以注射用更昔洛韋(湖北科益藥業，規格0.15 g/支，產品批號12090107)靜脈滴注治療，每次將5 mg/kg加入100 mL等滲生理鹽水中充分稀釋后給藥，持續滴注>1 h/次，2次/d(每次間隔12 h)，療程7 d。

1.5 療效判定標準[7]顯效：治療3 d內體溫開始下降，5 d內降至正常(腋溫≤37.2℃)，咽峽炎好轉，肝、脾、淺表淋巴結縮小，外周血異型淋巴細胞比例<0.10，一般情況好。有效：治療5 d內體溫開始下降，7 d內降至正常，咽峽炎好轉，淺表淋巴結縮小，外周血異型淋巴細胞比例下降，一般情況好轉。無效：治療7 d后腋溫仍>37.2℃，外周血異型淋巴細胞比例無改變，肝、脾、淋巴結等均未縮小。總有效率=(顯效例數+有效例數)/總例數×100%。

1.6 觀察指標 (1)觀察兩組患兒臨床癥狀、體征的改善時間，包括熱程(腋溫降至≤37.2℃)、咽峽炎好轉時間、淋巴結縮小(直徑縮小50%)時間、脾回縮時間和肝回縮時間。(2)根據患兒臨床情況定期復查其明顯異常的實驗室指標，包括血常規(白細胞計數)、異型淋巴細胞比例、肝功能[包括丙氨酸氨基轉移酶(ALT)]和心肌酶譜[包括肌酸激酶同工酶(CK-MB)]等，觀察這些指標的恢復正常(復常)時間，并觀察住院時間。(3)血液學指標檢測：a. 分別于治療前和治療7 d后采患兒空腹靜脈血9 mL。b. 運用實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司，型號LightCycle 96)檢測血清EBV-DNA載量，試劑盒(實時熒光定量PCR法)均由武漢明德生物提供，當EBV-DNA<500 copies/L時，則檢測結果判定為陰性，并統計兩組血清EBV-DNA陰轉率。c. 使用美國BD公司生產的BD Accuri C6型流式細胞儀及配套試劑(直接免疫熒光法)檢測外周血T淋巴細胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)水平。d. 采用實時熒光定量PCR儀檢測PBMC中Foxp3 mRNA表達水平，實時熒光定量PCR試劑盒、逆轉錄試劑盒等試驗所需試劑盒均購自日本Takara公司；Foxp3上游引物：TGAGCTGGCTGCAATTCTGG，下游引物：ATCTAGCTGCTCTGCATGAGGTGA；檢測結果用2-△△Ct表示，其中△△Ct=(待檢樣品的目的基因平均Ct值與其看家基因平均Ct值差值)-(對照組的目的基因平均Ct值與其看家基因平均Ct值差值)。e. 使用生化分析儀(美國貝克曼庫爾特公司，型號DXC600)及其配套試劑盒(免疫比濁法)檢測血清免疫球蛋白(Ig)A、IgG含量。f.采用酶標儀(美國BIO-RAD公司，型號680)測定血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-6、IL-2濃度，試劑盒(酶聯免疫法)均購自上海酶聯生物。以上操作均按說明書進行操作。(4)不良反應監測：觀察兩組患兒因治療而出現的不良反應。

2 結果

2.1 一般資料 98例IM患兒中，男性52例，女性46例；年齡1～13歲，平均年齡(6.41±2.27)歲；發病至入院時間1～7 d，平均時間(3.84±1.32)d。干擾素組患兒年齡為(6.07±2.42)歲，發病至入院時間為(4.05±1.37)d，血清EBV-DNA水平為(6.33±2.61)×104copies/L；更昔洛韋組患兒年齡為(6.63±2.19)歲，發病至入院時間為(3.69±1.28)d，血清EBV-DNA水平為(6.81±2.45)×104copies/L；兩組基線資料比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 兩組患兒臨床資料情況[例(%)]

2.2 兩組患兒臨床療效 治療7 d后，干擾素組總有效率高于更昔洛韋組(87.8% VS 71.4%)，血清EBV-DNA陰轉率高于更昔洛韋組(89.8% VS 73.5%)，兩組比較差異均有統計學意義(χ2值分別為4.020、0.045，均P<0.05)。見表2。

表2 兩組患兒臨床療效及血清EBV-DNA陰轉情況院時間均明顯縮短(均P<0.05)。兩組患兒淋巴結縮小時間、脾回縮時間和肝回縮時間比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表3。

2.3 兩組患兒臨床癥狀、體征及實驗室指標改善情況 與更昔洛韋組患兒相比，干擾素組患兒的熱程、咽峽炎好轉時間及異常實驗室指標(白細胞計數、異型淋巴細胞比例、ALT和CK-MB)復常時間和住

2.4 兩組患兒T淋巴細胞亞群水平及PBMC中Foxp3 mRNA表達水平 兩組患兒治療后外周血CD3+、CD8+水平均較本組治療前明顯下降(均P<0.05)，外周血CD4+水平、CD4+/CD8+比值及PBMC中Foxp3 mRNA表達水平均高于本組治療前(均P<0.05)；但干擾素組的良性調控作用均更明顯(P<0.05)。見表4。

表3 兩組患兒臨床癥狀、體征及實驗室指標改善情況

表4 兩組患兒外周血T淋巴細胞亞群水平及PBMC中Foxp3 mRNA表達水平

2.5 兩組患兒血清體液免疫及相關細胞因子檢測結果 與治療前相比，兩組患兒治療后血清IgA、IgG和IL-2濃度均明顯升高(均P<0.05)，血清TNF-α、IL-6水平則均明顯下降(均P<0.05)；但干擾素組的改善均更明顯(P<0.05)。見表5。

表5 兩組患兒血清體液免疫及相關細胞因子檢測結果

2.6 兩組患兒不良反應情況 更昔洛韋組49例患兒中，發生中性粒細胞減少6例，血小板減少3例，腎損傷1例；干擾素組49例患兒中，出現惡心、中性粒細胞減少各1例。兩組患兒不良反應均較輕微，其中更昔洛韋組患兒不良反應經對癥處理后均恢復正常，干擾素組患兒不良反應未予以特殊處理便自行恢復。干擾素組不良反應率低于對照組(4.1% VS 20.4%，χ2=6.077，P=0.014)。

3 討論

IM是兒童常見的EBV感染性相關疾病，目前尚無特效治療藥物，大多數予以抗病毒治療、免疫調節等對癥治療為主[8]。更昔洛韋是臨床上常用的抗EBV感染藥物之一，主要是通過抑制EBV多聚酶活性，終止EBV-DNA鏈的延伸，而產生抗EBV效應。一項Meta分析[9]表明，急性期IM應用更昔洛韋治療有助于提高IM治療有效率。不過部分IM患兒應用更昔洛韋治療時存在效果欠佳，一方面是由于部分IM患兒不產生特異性的胸腺嘧啶激酶(更昔洛韋抗病毒的作用靶點)，進而導致更昔洛韋無效；另一方面可能與B淋巴細胞內潛伏的EBV在復制時無需DNA多聚酶有關。同時更昔洛韋存在長期、潛在的生殖系統毒性和致癌性，因此在兒科人群中使用時應特別謹慎。

兒童免疫功能尚不成熟，當兒童受到EBV等病毒感染后，體內產生干擾素-α(IFN-α)的能力低下，體液中IFN-α含量明顯不足，因此應盡早采用外源性IFN-α進行干預[10]。rhIFN-α1b屬于生物治療制劑，是兒童IM常用的廣譜抗病毒藥物及免疫調節劑之一，主要通過阻斷EBV復制和增強機體免疫功能的雙重作用，加快清除IM患兒體內的EBV，從而迅速、明顯地緩解IM患兒癥狀，最終達到控制IM進展的目的[11]。目前rhIFN-α1b在治療兒童IM時主要有兩種給藥方式，即肌內注射和霧化吸入，其中后者具有療效高、兒童依從性高、安全性好、不良反應少等優點[12]。本研究顯示兒童IM采取rhIFN-α1b霧化吸入治療的總體療效優于更昔洛韋靜脈滴注治療，前者能更快速清除患兒體內EBV，促進病毒轉陰，加速患兒相關臨床癥狀、體征和實驗室指標的改善，縮短住院時間，與劉一波等[13]報道結果相近。從安全性評價來看，兩組患兒均未發生嚴重的不良事件，其中更昔洛韋組患兒出現的不良反應主要是中性粒細胞減少、血小板減少和腎損傷，經對癥處理后都立即緩解或消失，與單鳴鳳等[14]報道結果基本一致；干擾素組患兒的不良反應為惡心、中性粒細胞減少，均未予以特殊處理，停藥后自行恢復，與相關文獻[12-13]報道的結果相符。同時，干擾素組不良反應發生率為4.1%，低于更昔洛韋組(20.4%)。提示rhIFN-α1b霧化吸入治療方案的安全性高，還能有效避免因使用更昔洛韋而產生的長期潛在的生殖系統毒性等風險。

由EBV所致的機體免疫系統紊亂在兒童IM的整個病程中發揮著重要作用。Foxp3是促進CD4+CD25+Treg增殖分化和維持其功能的關鍵性調節基因，參與保持整體免疫細胞平衡的分子機制。研究[15]顯示，IM患兒存在細胞免疫異常，主要表現為外周血CD3+、CD8+水平均明顯升高，外周血CD4+水平和CD4+/CD8+比值均明顯下降，其免疫功能失衡原因可能是體內CD4+CD25+Treg數量減少及Foxp3表達不足而引起的免疫抑制功能缺陷所致。王強等[16]報道結果顯示，兒童IM急性期體內Foxp3 mRNA表達水平明顯降低，繼而引起細胞毒T淋巴細胞相關抗原-4(CTLA-4)的表達減少，從而削弱了CTLA-4對CD8+T淋巴細胞(殺傷性/抑制性)活化增殖的負性調節作用，造成CD8+T淋巴細胞(殺傷性/抑制性)異常增多，CD8+T淋巴細胞的殺傷功能亦可因Foxp3 mRNA表達下調而增強。本研究顯示，干擾素組和更昔洛韋組均能有效糾正IM患兒外周血T淋巴細胞亞群紊亂，增強體液免疫功能，上調PBMC中Foxp3 mRNA表達水平，但干擾素組的良性調節作用均更明顯。提示rhIFN-α1b可能通過進一步提高IM患兒PBMC中Foxp3 mRNA的表達水平，使其在改善細胞免疫及體液免疫功能異常方面發揮更明顯的作用。

研究[17-18]指出，兒童IM的發生發展及轉歸與TNF-α、IL-6、IL-2等細胞因子密切相關，其中過度分泌的TNF-α可通過刺激其他促炎因子釋放、趨化中性粒細胞向炎癥部位聚集，并誘導中性粒細胞釋放溶酶體酶和產生超氧陰離子等方式，參與機體組織的免疫炎性損傷[19]。IL-6是體內重要的炎性介質，也是介導天然免疫的少數免疫抑制因子，具有較強的免疫抗感染活性。Yan等[20]研究表明，IL-2是一種T淋巴細胞生長因子，能選擇性上調Foxp3表達水平，在誘導免疫耐受過程中起著重要作用。據此推測IM患兒PBMC中Foxp3 mRNA表達水平下降，可能與體內TNF-α、IL-6、IL-2異常表達有關。本研究顯示干擾素組和更昔洛韋組均能良性調控IM患兒血清中TNF-α、IL-6和IL-2的表達水平，但干擾素組對以上細胞因子的正性調控作用均更明顯，或許是干擾素組患兒PBMC中Foxp3 mRNA表達水平進一步上調的重要原因之一。

綜上所述，霧化吸入rhIFN-α1b治療兒童IM的整體療效及用藥安全性均優于常規治療方案(更昔洛韋靜脈滴注)，其作用可能與其明顯上調IM患兒PBMC中Foxp3 mRNA的表達水平，從而糾正患兒異常的細胞免疫功能，提高其體液免疫水平有關。但本研究為單中心小樣本研究，期待多中心大樣本的研究加以驗證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。