胃癌組織中miR-200a、miR-92a表達變化與患者臨床病理參數和預后的關系

郭青，趙艷爭，季艷霞，卓雷，王忠瑜，孫彩云

1 邯鄲市中心醫院腫瘤四科，河北 邯鄲 056000；2 河北工程大學附屬醫院整形美容科

胃癌是我國常見的惡性消化系統腫瘤，腫瘤登記數據顯示我國2019 年胃癌發病人數612 821 例，粗發病率為43.1/10 萬胃，胃癌死亡人數421 539例，病死率為29.6/10 萬，早期胃癌無特異性癥狀，檢出率低，患者預后較差［1］。微小核糖核酸（miRNAs）可通過與信使RNA（mRNA）結合誘導mRNA 降解，抑制蛋白翻譯調整下游基因表達，調控細胞增殖分化以及凋亡，在惡性腫瘤中，多數miRNAs 表達異常，發揮致癌或抑癌基因作用［2］。現有研究顯示，miR-200a 在宮頸癌［3］、上皮性卵巢癌［4］、膀胱癌［5］等多種惡性腫瘤中表達異常，與癌細胞增殖及腫瘤患者預后均有關。miR-92a 是與血管內皮細胞形成有關的miRNAs，miR-92a 表達異常與癌細胞惡性增殖分化、新生血管形成關系密切，miR-92a已被證實是結直腸癌［6］、食管癌［7］、前列腺癌［8］的潛在標志物。2017 年1 月—2018 年4 月，我們檢測了104 例胃癌患者癌組織中miR-200a、miR-92a 表達，并探討其與患者臨床病理參數和預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017 年1 月—2018 年4 月邯鄲市中心醫院收治的104 例胃癌患者，男57 例、女47 例，年齡50～71（60.23 ± 6.79）歲；腫瘤直徑≥4 cm 55 例，＜4 cm 49 例；組織分化程度：低分化44例，高、中分化60 例；浸潤深度：黏膜及黏膜下層34例，肌層、漿膜下及其外70 例；T 分期：T1-2期35 例，T3-4a期69例；N分期：N0期72例，N1-3期32例。納入標準：①均接受胃癌根治手術治療，術后病理組織學證實為胃癌；②術前未接受放化療；③符合手術治療指征。排除標準：①經影像學、病理學證實的其他部位原發腫瘤；②pTNM 分期Ⅲ期以上，術前接受新輔助放化療患者或采取保守治療者；③隨訪期間失去聯系者。所有患者及其家屬均知情同意并簽署同意書。本研究通過醫院倫理委員會批準（2020-1204）。

1.2 miR-200a、miR-92a 表達檢測方法 手術切除的癌組織標本及癌旁（距離癌組織邊緣5 cm 以上）經病理檢查證實為正常胃組織，采用液氮冷凍保存。取胃癌組織及癌旁組織標本各0.2 g，采用JXFSTPRP-Ⅱ冷凍研磨機（上海凈信實業發展有限公司）研磨組織，加入TRIzol試劑（美國Invitrogen生命技術公司）提取組織中總RNA。采用Multiskan SkyHigh全波長酶標儀（美國賽默飛公司）選取OD260/OD280為1.8～2.0 樣本，Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（美國賽默飛公司）將RNA 逆轉錄為cDNA。取2 μL cDNA 樣品加入RT-qPCR 反應體系，CFX96實時定量PCR 系統（美國BIO-RAD 公司）進行PCR擴增和基因表達分析。反應體系包括PrimeScript RT Enzyme Mix1 1.0 μL，RT Primer Mix 1.0 μL，5×PrimeScript Buffer 2 4.0 μL，RNase Free dH2O 4.0 μL，cDNA 模板2 μL，正反向引物各1 μL，加水至20μL。擴增條件：95 ℃預變性3 min，98 ℃變性2 s，67 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，循環30 次，每個循環延伸時間遞增1 s，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。引物設計由金斯瑞生物科技公司合成。miR-200a 正向引物：5′-GAGGATGAT TGCTGACGTGGA-3′，反向引物：5′-TCl CAGATGGTGAGCGAG-3′，擴增片段長度113 bp。miR-92a正向引物：5′-AGCTCTACGACTGTCACTCG-3′，反向引物：5′-GTATGCATTCTATCGTAG-3′，擴增片段長度108 bp。U6（內參）正向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。取PCR 擴增產物，2%瓊脂糖凝膠電泳30 min，DYCZ-30C 雙板夾芯式垂直注塑電泳儀進行凝膠成像分析。2-ΔΔCt法計算miR-200a、miR-92a 相對表達量。

1.3 隨訪 胃癌患者出院后均定期電話隨訪，術后第1年每3個月隨訪1次，術后第2年每6個月隨訪1次，隨訪3 年。統計隨訪期間胃癌患者總生存和無瘤生存情況，總生存時間為自病理確診到全因死亡或隨訪結束時間，無瘤生存時間為自病理確診到腫瘤復發和遠處轉移、全因死亡或隨訪結束時間。

1.4 統計學方法 采用SPSS25.0 統計軟件。Kolmogorov-SmiRnov 法檢驗miR-200a、miR-92a 擬合優度，符合正態分布計量資料以-x±s表示，比較采用獨立樣本t檢驗。Kaplan-Meier 生存分析不同miR-200a、miR-92a 表達胃癌患者生存情況，Log-Rank檢驗比較生存率差異，Cox回歸分析影響胃癌患者生存的危險因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織和癌旁組織中miR-200a、miR-92a 表達比較 胃癌組織和癌旁組織中miR-200a 相對表達量分別為1.49±0.47、3.19±1.07，miR-92a 相對表達量分別為2.93 ± 0.48、1.24 ± 0.30，胃癌組織中miR-92a 表達高于癌旁組織（P＜0.05），miR-200a表達低于癌旁組織（P＜0.05）。

2.2 胃癌組織中miR-200a、miR-92a 表達與患者臨床病理參數的關系 浸潤至肌層、漿膜下及其外、T3-4a期、N1-3期胃癌患者癌組織中miR-200a 表達低于浸潤至黏膜及黏膜下層、T1-2期、N0胃癌患者（P均＜0.05），miR-92a 表達高于浸潤至黏膜及黏膜下層、T1-2期、N0期胃癌患者（P均＜0.05）。不同年齡、性別、腫瘤直徑、組織分化程度miR-200a、miR-92a 表達比較無統計學差異（P均＞0.05），見表1。

表1 胃癌組織中miR-200a、miR-92a表達與患者臨床病理參數的關系

2.3 miR-200a、miR-92a 表達與胃癌患者生存的關系 隨訪期間胃癌死亡33 例，復發和遠處轉移12例。Kaplan-Meier 生存分析結果示miR-200a＜1.49（56例）胃癌患者3年總生存率為58.93%（33/56），3年無瘤生存率為44.64%（25/56），低于miR-200a≥1.49（48 例）胃癌患者的79.17%（38/48）、70.83%（34/48），miR-92a≥2.93（57例）胃癌患者3年總生存率為61.40%（35/57），3 年無瘤生存率為45.61%（26/57），低于miR-92a＜2.93（47 例）胃癌患者的78.72%（37/47）、70.21%（33/47）（Log-Rankχ2miR-200a 分別為5.177、8.089，P分別為0.023、0.005；Log-Rankχ2miR-92a 分別為3.990、8.392，P分別為0.046、0.004）。

2.4 影響胃癌患者預后的Cox 回歸分析 單因素Cox 比例風險回歸分析結果顯示，T 分期、N 分期、miR-200a＜1.49、miR-92a≥2.93 與胃癌患者預后有關（P均＜0.05），見表2。多因素Cox 比例風險回歸模型結果顯示，N 分期、miR-200a＜1.49、miR-92a≥2.93是胃癌患者不良預后的危險因素（P均＜0.05），見表3。

表2 影響胃癌患者預后的單因素Cox比例風險回歸分析

表3 影響胃癌患者預后的多因素Cox比例風險回歸分析

3 討論

胃癌是全球第五大常見癌癥和第三大癌癥死亡原因，幽門螺桿菌感染、年齡、高鹽攝入量、水果和蔬菜攝入量低是胃癌發病的高危因素。胃癌早期以上腹不適、反酸、噯氣、食欲減退等非特異性癥狀為主，易與胃炎、胃潰瘍等胃慢性疾病混淆，早期檢出率低，多數患者確診即晚期，生存率低［9］。miRNAs 是廣受關注的新型小分子非編碼RNA，通過抑制mRNA 翻譯或促進mRNA 降解在轉錄后水平調節基因表達，參與惡性腫瘤、心血管疾病、代謝疾病在內的多種疾病病理過程［10］。現有研究顯示，多種miRNAs參與胃癌的發病和進展過程［11-12］。

miR-200a 是上皮表型的關鍵調節因子，位于1號染色體，主要表達于細胞間質及細胞器周邊，可靶向E-鈣黏蛋白轉錄抑制因子E 盒鋅指蛋白1、Smad相互作用蛋白1 調控上皮間質轉化和腫瘤侵襲轉移［13］。研究顯示，miR-200a 在乳腺癌中通過抑制致癌基因—去乙酰化酶沉默信息調節因子2 相關酶1表達抑制乳腺上皮間質轉化過程［14］。miR-200a 在宮頸癌組織和細胞系中表達上調，高表達miR-200a可上調缺氧誘導因子1-α 和血管內皮生長因子表達促進卵巢癌細胞增殖、集落形成和侵襲［3］。miR-200a 被認為是浸潤性膀胱癌侵襲的正向調節因子，miR-200a 通過抑制miR-16 表達，上調c-Jun 氨基末端激酶2 表達，基質金屬蛋白酶-2 轉錄，最終導致浸潤性膀胱癌侵襲和轉移［15］。本研究結果表明，miR-200a 在胃癌組織中表達下調，miR-200a 低表達與胃癌浸潤深度、T 分期、N 分期均有關，這與miR-200a 在乳腺癌［14］的作用機制一致，但與宮頸癌、膀胱癌［3，15］的作用機制相反，說明miR-200a 在不同惡性腫瘤中可能發揮不同作用。基礎研究顯示，miR-200a 過表達可抑制腫瘤壞死因子-α 誘導蛋白3表達和受體相互作用蛋白激酶1泛素化，促進半光天冬酶-8 裂解，腫瘤壞死因子-α 相關的凋亡誘導配體激活，引起胃癌細胞凋亡［16］。miR-200a-3p還可通過與Kruppel 樣轉錄因子12 的3'-UTR 區結合抑制Kruppel 樣轉錄因子12 表達，使細胞周期停滯于G1/S 期，抑制胃癌細胞增殖和遷移，促使胃癌細胞凋亡［17］。由此可見在胃癌中miR-200a 可能發揮抑癌基因作用，miR-200a 表達缺失可能是胃癌惡性進展的原因之一。通過隨訪發現，miR-200a 低表達與胃癌患者低生存率有關，miR-200a 低表達是胃癌患者術后生存率低下的原因，提示miR-200a 可以作為胃癌預后評估的參考指標。

miR-17～92 基因簇位于染色體基因座13q31.3，編碼miR-92a、miR-17、miR-18a、miR-19a/b、miR-20a，其中miR-92a是目前研究最多的miRNAs 之一，可調控心、肺、免疫系統等器官發育及血管形成過程，在惡性腫瘤中，miR-92a 可促使腫瘤細胞增殖，抑制腫瘤細胞凋亡，提高腫瘤細胞侵襲和轉移能力，在腫瘤進展中發揮致癌基因作用［18］。miR-92a 在結直腸癌組織中表達上調，通過直接靶向抑制抑癌基因-RECK表達，上調基質金屬蛋白酶表達，促使癌細胞侵襲和轉移［19］。miR-92a-3p 可通過Toll 樣受體7/8 依賴性方式刺激腫瘤相關巨噬細胞分泌白細胞介素-6，促進脂肪肉瘤細胞增殖、侵襲和轉移［20］。miR-92a-3p還可通過調控EGFR、K-RAS和PI3K/AKT信號傳導，參與肺腺癌和肺鱗癌發病和進展［21］。本研究發現，胃癌組織中miR-92a 表達升高，miR-92a 表達與胃癌浸潤深度、T分期、N分期有關，說明miR-92a過表達與胃癌發生及惡性侵襲行為有關。miR-92a 參與胃癌的發病機制：Kruppel樣轉錄因子2可抑制腫瘤發生，促使腫瘤細胞凋亡，是miR-92a-3p的直接靶標，miR-92a-3p通過靶向抑制Kruppel樣轉錄因子2 表達，促進胃癌細胞的增殖和侵襲［22］。其次，F 框/WD-40 域蛋白7（FBXW 7）是一種抑癌基因，FBXW 7 過表達可抑制癌細胞增殖，促使癌細胞凋亡，miR-92a 可靶向抑制FBXW 7 促進胃癌細胞增殖、遷移和侵襲，并減少胃癌細胞凋亡［23］。因此，miR-92a 過表達可能促使胃癌細胞惡性增殖以及侵襲和轉移，在胃癌發病機制中發揮促癌基因作用。生存和回歸分析結果顯示，miR-92a與胃癌患者術后生存有關，miR-92a高表達是胃癌患者預后不良的危險因素，提示miR-92a是胃癌患者預后評估的潛在指標。REN 等［24］認為，miR-92a 是胃癌患者生存期縮短的重要預測因子。

miR-200a、miR-92a 在胃癌發病和進展過程中是否存在相互作用仍不清楚，但兩者均與胃癌浸潤深度、T 分期、N 分期和生存率有關，說明miR-200a、miR-92a 可能共同參與胃癌發生發展。本研究選擇miR-200a、miR-92a 兩個指標原因為單個指標不能反映胃癌病情進展，綜合兩個指標可以更全面判斷病情進展方向，為預后評估提供更可靠指導。

綜上所述，胃癌組織中miR-200a 表達下調，miR-92a表達上調，miR-200a、miR-92a 可作為胃癌病情分析和預后評估的潛在指標。本研究不足之處在于只檢測了早期根治術患者的數據，對于晚期胃癌miR-200a、miR-92a 表達特點，其與晚期胃癌惡性指標和預后的關系尚不清楚，仍需進一步研究探討。