血清miR-103、sCD40L對急性缺血性腦卒中治療效果及預后評估的價值

韓旭東，梁志剛，閻志慧，張惠龍

1 煙臺海港醫院神經內科，山東 煙臺 264012；2 煙臺毓璜頂醫院神經內科；3 煙臺山醫院神經內科

急性缺血性腦卒中（AIS）是最常見的卒中類型，發病急，病情進展快［1］。目前AIS治療以改善腦循環、抗氧化、清除氧自由基、營養神經等為主，療效評估主要依賴于美國國立衛生研究院卒中量表（NIHSS）評分［2］，存在主觀性強、重復性差的弊端，而準確判斷AIS治療效果對進一步治療和預后評估均有重要意義。動脈粥樣硬化是推動大中型動脈病變的主要原因，與AIS發病、神經功能惡化密切相關［3］。微小核糖核酸-103（miR-103）可通過靶向長鏈非編碼RNA-WDR59促使內皮細胞損傷，還可靶向Kruppel樣因子4促進促炎因子和趨化因子表達，參與動脈粥樣硬化過程［4-5］。可溶性CD40 配體（sCD40L）主要來源于活化的血小板，與動脈粥樣硬化和血栓形成事件有關［6］。2019年2月—2021年1月，我們探討了血清miR-103、sCD40L在AIS患者療效判斷和預后評估中的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2019 年2 月—2021 年1 月煙臺海港醫院收治的142 例AIS 患者（AIS 組），其中男92 例、女50 例，年齡（62.75±3.71）歲、體質量指數（23.95±2.18）kg/m2，有吸煙史77例、飲酒史83例。納入標準：①符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》診斷流程和標準［7］；②起病至入院時間＜24 h；③入院后接受抗血小板、擴血管、營養腦神經等AIS常規治療。排除標準：①合并中樞神經系統感染、脫髓鞘疾病、運動障礙性疾病等其他神經系統疾病者；②合并嚴重心血管疾病，惡性腫瘤，肝腎功能障礙者；③凝血功能障礙，不能耐受抗血小板治療者；④隨訪失聯者。另選擇70 例同期于我院體檢的查體健康者為對照組，均排除心腦血管疾病，其中男41例、女29 例，年齡（62.19 ± 3.02）歲、體質量指數（23.51±2.07）kg/m2，有吸煙史35例、飲酒史38例。兩組臨床基線資料均衡可比（P均＞0.05）。受試者均知情同意并簽署同意書。本研究通過醫院倫理委員會批準（2021141）。

1.2 臨床治療及效果評價 患者均接受靜脈溶栓、機械取栓或抗血小板治療，并給予依達拉奉（30 mg+5.00%葡萄糖注射液100 mL 靜脈滴注，2 次/天）清除氧自由基，甲鈷胺（每次0.5 mg，3 次/天，口服）營養腦神經。根據患者合并基礎疾病情況給予降糖（皮下胰島素注射）、降壓（卡托普利）或調脂（阿托伐他汀鈣）治療等，連續治療2周。2周后參考文獻［8］方法進行療效評價：NIHSS 評分減少91.00%～100.00%，殘疾程度0 級為痊愈；NIHSS 評分減少46.00%～90.00%，殘疾程度1～3 級為顯效；NIHSS評分減少18.00%～45.00%，臨床癥狀有所好轉為有效；NIHSS 評分減少＜18.00%或增加＞18.00%，甚至死亡為無效。有效=痊愈+顯效+有效，根據治療效果將患者分為有效組（106例）和無效組（36例）。

1.3 血清miR-103、sCD40L 檢測 所有AIS 患者分別于治療前、治療3 d、治療7 d、治療14 d，對照組于體檢當日采集血標本，取血液凝固后上層血清離心（3 000 r/min，半徑15 cm，時間10 min）處理后冷凍保存待檢。取血清樣本加入TRIzol（美國Invitrogen公司）提取總RNA，NanoDrop-1000 紫外分光光度計（NanoDrop公司）檢測RNA純度和濃度。取20μg總RNA，采用M-MLV 逆轉錄酶（Epicentre 公司）將RNA 逆轉錄為cDNA。采用實時熒光RT-qPCR 法檢測血清miR-103表達：CFX96實時熒光PCR 儀（美國Bio-Rad公司），引物設計由金域醫學檢驗中心完成。miR-103 正向引物：5'-TGATGCTGGTGCTAGAAGT-3'，反向引物：：5'-TCTCCACAGAACAGGCAAG-3'；U6 正向引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性15 s、65 ℃退火20 s、75 ℃延伸15 s共40個循環。擴增反應結束后進行熔解曲線分析，共做3 次平行試驗。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-103相對表達量。取血清樣本，采用Multiskan SkyHigh 全波長酶標儀（美國賽默飛公司）運用酶聯免疫吸附試驗檢測血清sCD40L水，試劑盒購自上海紀納生物有限公司（批號201930）。

1.4 預后觀察 患者出院后定期電話隨訪，囑不適隨診，指導患者按時按量服用抗血小板、降壓和降糖藥物。出院3 個月后采用改良RANKIN 量表（mRS評分）［9］評價患者殘疾程度，分為0～5 共6 個等級，0、1分為無明顯殘疾；2分為輕度殘疾；3分為中度殘疾；4分為重度殘疾；5分為嚴重殘疾。0、1分患者歸為神經預后良好組（99 例），2～5 分歸為神經預后不良組（43例）。

1.5 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件。符合正態分布計量資料以-x±s表示，比較采用重復測量數據方差分析或獨立樣本t檢驗。計數資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗。Logistic 逐步回歸分析AIS 患者預后不良的危險因素。采用受試者工作特征（ROC）曲線分析miR-103、sCD40 評估AIS 患者治療效果及預后評估的價值。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AIS組和對照組血清miR-103、sCD40L比較 AIS組與對照組血清miR-103 水平分別為3.29 ± 0.61、1.42 ± 0.38，血清sCD40L 水平分別為（362.77 ±62.18）、（83.26 ± 13.47）pg/mL，AIS 組血清miR-103、sCD40L水平均高于對照組（P均＜0.05）。

2.2 不同療效組治療期間血清miR-103、sCD40L比較 兩組治療前后血清miR-103 表達、sCD40L 水平差異有統計學意義（F組間分別為23.251、32.0541，P組間＜0.05），有效組治療后血清miR-103 表達、sCD40L 水平先升高后下降（F時間分別為31.091、27.025，P時間＜0.05），無效組治療后血清miR-103 表達、sCD40L 水平治療前后比較差異無統計學意義（F時間分別為2.091、2.025，P時間均＞0.05）。兩組間存在交互效應（F交互分別為29.668、25.032，P交互＜0.05），兩組治療前、治療3 d 血清miR-103 表達、sCD40L 水平比較無統計學差異（P均＞0.05），有效組治療7 d、治療14 d 血清miR-103 表達、sCD40L 水平低于無效組（P均＜0.05），見表1。

表1 兩組治療期間血清miR-103表達、sCD40L水平比較（-x ± s）

2.3 影響AIS 患者預后的因素分析 預后不良組年齡、大梗死比例、心房顫動、NIHSS評分、發病至入院時間、總膽固醇（TC）、空腹血糖（FPG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、治療14 d 血清miR-103、治療14 d 血清sCD40L 高于預后良好組（P均＜0.05），兩組性別、體質量指數、吸煙史、飲酒史、高血壓、糖尿病、高血脂癥、左心房血栓形成、梗死部位、心率、收縮壓、舒張壓、TG、HDL-C、LDL-C 治療3、7 d 的miR-103、sCD40L 比較差異均無統計學意義（P均＞0.05），其他指標比較見表2。以AIS 患者預后為因變量（賦值：預后良好=0，預后不良=1），以年齡、病變大小（賦值：腔隙性梗死=1，小梗死=2，大梗死=3）、心房顫動（賦值：否=0，是=1）、發病至入院時間、LDL-C、HbA1c，收縮壓、舒張壓、NIHSS 評分、TC、FPG、治療14 d 血清miR-103、治療14 d 血清sCD40L 為自變量，逐步法排除無關變量，Logistic 逐步回歸分析發現，NIHSS評分、治療14 d 血清miR-103、治療14 d血清sCD40L 是AIS 患者預后不良的危險因素（P均＜0.05），見表3。

表2 影響AIS患者預后的單因素分析

表3 影響AIS患者預后的Logistic回歸分析

2.4 miR-103、sCD40L 判斷AIS 治療療效及預測患者預后的價值 治療7、14 d 的miR-103、sCD40L判斷AIS 治療療效的最佳截斷值分別為2.15、336.32 pg/mL、2.03、316.35 pg/mL，曲線下面積（AUC）分別為0.756、0.724、0.592、0.572。治療7 d miR-103 聯合sCD40L 判斷AIS 治療療效的AUC為0.875，高于治療7 d miR-103、sCD40L單獨（Z分別為2.513、3.146，P均＜0.05）。治療14 d miR-103、sCD40L 預測AIS 患者預后的最佳截斷值分別為2.95、312.16 pg/mL，AUC分別為0.763、0.732，治療14 d miR-103 聯合sCD40L 預測AIS 患者預后的AUC為0.854，高于治療14 d miR-103、sCD40L 單獨判斷（Z分別為2.201、2.543，P均＜0.05），見表4。

表4 miR-103、sCD40L判斷AIS治療療效及預測患者預后的效能

3 討論

AIS 是腦組織血液供應異常導致的腦缺血性疾病，可引起神經細胞壞死或凋亡，出現相應的神經缺損癥狀，最終遺留殘疾甚至引起患者死亡。高齡、肥胖、高血壓、糖尿病、冠心病、吸煙等是AIS 發病的高危因素［10］。動脈粥樣硬化是AIS 發病、進展以及復發的主要原因，動脈粥樣硬化斑塊脫落可引起腦血管堵塞以及相應腦組織缺血缺氧，神經細胞凋亡和壞死，影響神經功能障礙［11］。

miRNAs 是短、單鏈、非編碼RNA，通過與信使RNA 相互作用影響蛋白質合成調控基因轉錄后表達，某些miRNAs 通過調節動脈粥樣硬化易感基因及其轉錄后基因表達，影響細胞內合成蛋白質水平，引起內皮細胞、平滑肌細胞和白細胞失調，促使動脈粥樣硬化斑塊形成［12］。miR-103是miR-15/107家族成員?，F有報道顯示，miR-103 通過靶向長鏈非編碼RNA WDR59 表達，增加增殖內皮細胞對氧化低密度脂蛋白誘導的有絲分裂畸變的易感性，促進內皮適應不良，血管炎癥及動脈粥樣硬化的發生［13］。本研究發現，治療有效組miR-103 表達于治療7 d 后下降，但無效組并無統計學差異，說明miR-103 表達與AIS療效存在密切關系。ROC 曲線分析結果示治療7 d血清miR-103表達判斷AIS臨床療效的價值最高，分析原因為治療7 d后多數治療有效患者病情基本趨于穩定，此時檢測血清miR-103 表達可更好地鑒別不同療效患者。Logistic 逐步回歸分析發現，miR-103 表達增高是AIS 患者神經預后不良的危險因素。唐蕾等［5］認為，miR-103 表達上調與AIS 患者神經功能惡化有關。分析原因為miR-103 可促使海馬神經元中核因子-κB 活化，誘導神經細胞壞死凋亡［14］，miR-103 還可靶向抑制血管內皮生長因子，抑制新生血管形成，導致腦梗死體積增加［15］，促使神經功能惡化。

sCD40L 是CD40 的可溶性配體，來源于活化血小板，具有促炎和促凝作用，在頸動脈、腎動脈、冠狀動脈粥樣硬化中增加，被認為是心血管疾病的潛在生物學指標［16］。本研究發現，血清sCD40L 水平與AIS治療效果有關，治療7天血清sCD40L水平在AIS治療效果評估中具有較高價值，治療14 天sCD40L水平增高是AIS 患者神經預后不良的危險因素，提示sCD40L 可作為AIS 療效判斷和預后評估的指標。推測sCD40L 參與AIS 患者不良預后的機制：CD40/CD40L通過激活炎癥和凝血反應導致血管疾病和動脈粥樣硬化，血小板表面CD40L和sCD40L表達可促使膠原蛋白釋放，膠原蛋白誘導p38 MAP激酶、細胞外信號調節激酶1/2和熱休克蛋白27磷酸化、基質金屬蛋白酶-2表達，活性氧產生，促使動脈粥樣硬化形成［17］。其次，sCD40L 還通過糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 配體依賴性機制刺激血小板活化，導致和加強血小板—白細胞黏附，募集白細胞到血栓部位，加劇局部炎癥反應，促使動脈粥樣硬化和血栓形成［18］，最終引起AIS 神經功能惡化和不良結局的發生。本研究miR-103、sCD40L在治療3 d時增高可能原因為尚處于病情進展階段，隨著溶栓、抗血小板治療后腦缺血癥狀得以控制，miR-103表達逐漸降低

綜上所述，AIS 治療無效、預后不良患者血清miR-103 表達、sCD40L 水平均增高，miR-103、sCD40L 增高是AIS 患者預后不良的危險因素。治療7 d miR-103、sCD40L 可用于判斷AIS 治療效果，治療14 d miR-103、sCD40L 可作為AIS 患者預后評估的潛在指標，miR-103 聯合sCD40L 可提高療效判斷和預后評估的效能。本研究局限之處在于樣本量偏少，可能存在統計學偏倚，尚待進一步擴大樣本量加以證實。