痰濕內阻慢性失眠大鼠模型建立及半夏秫米湯基于HPA軸、炎癥因子的治療機制

張艷，楊嫚，劉西建，張喆，李琳，辛丹

1 山東中醫(yī)藥大學，濟南 250355；2 山東省委黨校燕山校區(qū)衛(wèi)生所

據報道，5%～10%的成年人患有慢性失眠［1］。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的不斷加快，其患病率呈逐年上升及低齡化趨勢。慢性失眠不僅嚴重影響人們的工作和生活，而且與心腦血管疾病、糖尿病、精神疾病的發(fā)生密切相關［2-4］。截至目前，慢性失眠仍缺乏行之有效的治療方法，藥物治療是其主要的治療方法［5］。苯二氮?類、非苯二氮?類、褪黑素受體激動劑等是臨床常用藥物，但往往會產生耐藥、戒斷、心理及軀體依賴、記憶力受損等不良反應［6］。始載于《黃帝內經》的半夏秫米湯，為臨床治療失眠的基礎方，尤宜于痰濕內阻慢性失眠。既往研究證實，該方具有鎮(zhèn)靜催眠作用［7］，但作用機制并未完全闡明。下丘腦—垂體—腎上腺（HPA）軸失調是慢性失眠神經生物學因素之一［8］。2018 年10 月—2020 年1 月，我們探討了痰濕內阻慢性失眠大鼠模型的建立方法，并基于HPA 軸及炎癥因子變化探討了半夏秫米湯干預痰濕內阻慢性失眠的治療機制。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：SPF 級雄性Wistar 大鼠，6 周齡，體質量（200 ± 20）g，48 只，購自山東濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，實驗動物許可證號：SYXK（魯）2014007。飼養(yǎng)條件：12 h/12 h明暗交替，室溫（22±2）℃，相對濕度40%～60%。藥物：半夏秫米湯組成：半夏五合（60 g）秫米1 升（120 g）。生半夏購于鄭州瑞龍制藥股份有限公司，秫米購于山東鶴來香食品有限公司，經山東中醫(yī)藥大學中藥鑒定室劉紅燕老師鑒定，生半夏為天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit. 的干燥塊莖，秫米為禾本科植物高粱Sorghum vulgarePers 的種仁。二藥加6 倍體積冷水浸泡1 h，加熱煮沸后煎煮1 h，減壓低溫40 ℃濃縮，濃縮至濃度為1.5 g/mL生藥水煎液，置于4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩Ｔ噭┘皟x器：戊巴比妥鈉購于北京普博斯生物科技有限公司；地西泮片購于山東信宜制藥有限公司；固態(tài)豬油（自制）。腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素4（IL-4）、IL-10、白細胞介素1β（IL-1β）、γ 氨基丁酸（GABA）、去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）、促腎上腺皮質激素（ACTH）、皮質酮（CORT）、大鼠促腎上皮質激素釋放激素（CRH）ELISA 試劑盒購于江蘇晶美生物科技有限公司。全自動化學發(fā)光分析儀（型號：Tanon-5200）購于上海天能科技有限公司；臺式高速低溫離心機（型號：JW-3021HR）購于安徽嘉文儀器設備有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（型號：GNP-908）購于上海精宏實驗設備有限公司；酶標儀（型號：352 型）；單平臺水環(huán)境：大鼠箱（型號：R1，規(guī)格：460 mm×300 mm×160 mm），內置1 直徑為80 mm，高90 mm，厚15 mm的平臺，水面距平臺約10 mm。

1.2 痰濕內阻慢性失眠大鼠模型制備 采用隨機數字表法將大鼠分成6組：空白組、痰濕內阻慢性失眠組及半夏秫米湯低、中、高劑量組和地西泮組，每組8 只。除空白組外，其余5 組均給予高脂飼料［9］+豬油3 mL 灌胃/只/天，連續(xù)10 周，并于第8 周采用單平臺水環(huán)境法，每天自13：00 至次日9：00 剝奪睡眠，連續(xù)21 d，制備痰濕內阻慢性失眠大鼠模型。動物晝夜節(jié)律消失，對周圍聲音、光刺激敏感，易激惹，興奮性增高，睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時間與空白組相比差異有統(tǒng)計學意義；體質量增加，呈腹部肥胖狀態(tài)，精神萎靡不振，毛色萎黃黯淡，活動度下降，飲食減少，便溏，肛周不潔，舌黯紅，苔白厚膩，符合中醫(yī)“痰濕證”特點，血清甘油三酯（TG）、膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）較空白組升高，高密度脂蛋白（HDL-C）降低，差異有統(tǒng)計學意義，則造模成功。造模成功后，各給藥組按照人鼠劑量換算（根據60 kg 成人臨床劑量，生半夏15 g、秫米30 g，生半夏30 g、秫米60 g，生半夏60 g、秫米120 g，地西泮片5 mg），半夏秫米湯低、中、高劑量組按4.69、9.38、18.75 g/kg灌胃給予半夏秫米湯水煎液，地西泮組按0.75 mg/kg 灌胃給予地西泮水溶液，痰濕內阻慢性失眠組及空白組灌胃給予1 mL/100 g 生理鹽水，每日1次，連續(xù)14 d。

1.3 動物體征及行為學變化 觀察并記錄動物體征，如體質量、活動、毛色、飲食等變化。

1.4 血脂檢測 第7 周后，乙醚氣體麻醉，各組大鼠內眥取血，常溫離心后取血清，置于-80 ℃冰箱，全自動生化儀檢測血清TG、TC、LDL-C、HDL-C。

1.5 睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時間測定 第10 周后，在預實驗基礎上，痰濕內阻慢性失眠組大鼠與空白組大鼠按照90 mg/kg 腹腔注射戊巴比妥鈉溶液，記錄睡眠潛伏期及睡眠持續(xù)時間。

1.6 血清ACTH、CORT、CRH、GABA、NE、DA 測定 末次灌胃后禁食24 h，乙醚氣體麻醉，各組大鼠內眥取血，常溫離心后取上清，置-80 ℃冰箱，用ELISA 法檢測血清ACTH、CORT、CRH、GABA、NE、DA，按照試劑盒說明書操作。

1.7 下丘腦IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10 測定 末次灌胃后禁食24 h，取血后，斷頭，冰上迅速剝離大腦，取出下丘腦，置于-80 ℃冰箱，用ELISA 法檢測下丘腦IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10，按照試劑盒說明書操作。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料用-x±s表示，比較采用t檢驗；多組間比較采用One-way-ANOVA 方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 動物體征及行為學變化 實驗第2 周，與空白組相比，痰濕內阻慢性失眠組大鼠大便黏膩，肛周不潔；第5周時空白組、痰濕內阻慢性失眠組大鼠體質量分別為（259.26±34.48）、（263.74±29.82）g，第7周時分別為（257.23±23.15）、（272.90±32.05）g，第5周、第7周痰濕內阻慢性失眠組大鼠體質量大于空白組，腹部肥胖，精神萎靡不振，毛色萎黃黯淡，活動度下降，飲食減少，便溏，舌黯紅，苔白厚膩，符合中醫(yī)“痰濕證”特征。實驗第10周，晝夜節(jié)律消失，對周圍聲音、光刺激敏感，易激惹，興奮性增高，符合失眠特征。

2.2 痰濕內阻慢性失眠組與空白組血清TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比較 見表1。

表1 痰濕內阻慢性失眠組與空白組大鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比較（mmol/L，-x±s）

2.3 痰濕內阻慢性失眠組與空白組睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時間比較 10周后，痰濕內阻慢性失眠組與空白組睡眠潛伏期分別為（20.87 ± 3.97）、（11.11 ±3.65）min，睡眠持續(xù)時間分別為（41.43 ± 10.11）、（65.89±21.61）min。與空白組比較，痰濕內阻慢性失眠組睡眠潛伏期延長，睡眠持續(xù)時間縮短（P均＜0.05）。

2.4 各組大鼠血清ACTH、CORT、CRH、GABA、NE、DA水平比較 見表2。

表2 各組大鼠血清ACTH、CORT、CRH水平比較（-x±s）

2.5 各組大鼠下丘腦IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10 含量比較 見表3。

表3 各組大鼠下丘腦IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10含量比較（-x±s）

3 討論

中醫(yī)認為，痰濕內阻是慢性失眠難以治愈的主要原因之一。半夏秫米湯化痰通利、引陽入陰安神，有“失眠第一方”之美稱。方中半夏燥濕化痰而安神，秫米能健脾止瀉，化痰安神。

構建中醫(yī)證候特點的失眠動物模型，是防治失眠的重要環(huán)節(jié)［10］。截至目前，尚未見痰濕內阻失眠大鼠模型的報道。本研究首次采用高脂飼料+單平臺水環(huán)境法復制痰濕內阻慢性失眠模型，結果證實該方法可行。造模后模型大鼠符合中醫(yī)“痰濕證”特點，同時符合慢性失眠模型標準。

HPA 軸是調控機體應激反應的神經內分泌系統(tǒng)，HPA 軸功能亢進是引起慢性失眠的重要因素。HPA 軸的激活和CRH 的分泌增加，使促腎上腺皮質激素（ACTH）和皮質酮（CORT）濃度增加，產生覺醒效應［11］。本實驗中模型大鼠在睡眠剝奪后，處于應激狀態(tài)，呈現(xiàn)HPA 軸亢進，ACTH、CORT、CRH 分泌增多，給予半夏秫米湯后，ACTH、CORT、CRH 降低，表明半夏秫米湯對興奮的HPA 軸有抑制作用，從而調節(jié)睡眠，尤以半夏秫米湯高劑量組效果最好。

炎癥因子不僅調節(jié)免疫，而且調節(jié)睡眠，是近幾年失眠研究的熱點之一。一般認為，TNF-α和IL-1β是促眠因子［12］。IL-4、IL-10 可抑制睡眠［13］。而且TNF-α 和IL-1 還可以激活HPA 軸［14］。本研究中，模型大鼠在睡眠剝奪后，反饋性地使促眠因子TNF-α、IL-1β 升高，抑制睡眠的IL-4、IL-10 降低，而且TNFα、IL-1β的升高可能還會激活HPA 軸。給予半夏秫米湯后，TNF-α、IL-1β 降低，IL-4、IL-10 升高，表明半夏秫米湯可能通過調控炎癥因子而抑制亢進的HPA軸調節(jié)睡眠，尤以高劑量效果最好。

睡眠受到多種中樞神經遞質調節(jié)，如γ-氨基丁酸（GABA）、多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）等。GABA 是腦內主要的抑制性氨基酸類遞質［15］。DA、NE是與覺醒有關的神經遞質。本實驗中，模型大鼠血清GABA、DA、NE 升高，給予半夏秫米湯后，上述指標均降低，表明半夏秫米湯通過抑制上述神經遞質含量而干預睡眠，尤以半夏秫米湯高劑量組效果最好。

綜上所述，高脂飲食+單平臺水環(huán)境法復制痰濕內阻慢性失眠大鼠模型可行。半夏秫米湯可通過抑制亢進的HPA 軸、調控IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10、GABA、NE、DA 表達而干預痰濕內阻慢性失眠，以半夏秫米湯高劑量（原方劑量）效果最佳。