環脂蛋白20 調控組蛋白H2B 泛素化經NF-κB信號通路對巨噬細胞遷移的影響

卞姝，張曼，劉巖，姜朝陽，陳紅

沈陽醫學院附屬中心醫院全科醫學科，沈陽110024

摘要：目的 探討環指蛋白20（RNF20）調控組蛋白H2B 泛素化（H2Bub）經核因子-κB（NF-κB）途徑對巨噬細胞遷移的影響。方法 將培養好的巨噬細胞分為7 組，A 組（對照組）：培養48 h；B 組（ox-LDL 刺激組）：50 mg/mL ox-LDL 刺激巨噬細胞48 h；C 組（ox-LDL+oe-RNF20 轉染組）：oe-RNF20 轉染巨噬細胞后用50 mg/mL ox-LDL 刺激48 h；D 組（ox-LDL+pcDNA 轉染對照組）：pcDNA 轉染巨噬細胞后用50 mg/mL ox-LDL 刺激48 h；E 組（ox-LDL+SN50 干預組）：50 mg/mL ox-LDL 刺激巨噬細胞24 h 后再給予10 μg/mL 的SN50 處理24 h，共干 預48 h；F 組（ox-LDL+LY 294002 干預組）：50 mg/mL ox-LDL 刺激巨噬細胞24 h 后再給予10μg/mL 的LY 294002 處理24 h，共干 預48 h；G組（ox-LDL+p38干預組）：50 mg/mL ox-LDL 刺激24 h后再給予10μg/mL的p38，共干 預48 h。采用Transwell法觀察巨噬細胞遷移數量，Western blotting 法檢測RNF20、H2B、H2Bub、NF-κB 及白細胞介素6（IL-6）表達。結果 在ox-LDL刺激的巨噬細胞中，與A組比較，B組RNF20蛋白表達、H2Bub/H2B降低，巨噬 細胞遷移數量增多，NF-κB和IL-6 蛋白表達增加（P 均＜0.01）。在RNF20 過表達細胞模型中，與B 組比較，C 組RNF20 蛋白表達、H2Bub/H2B 增加，NF-κB、IL-6 蛋白表達減少，巨噬 細胞遷移數量減少（P 均＜0.01）；D 組RNF20 蛋白表達、H2Bub/H2B、NF-κB、IL-6 無明顯改變，巨噬 細胞遷移數量無明顯改變（P 均＞0.05）。給予SN50（NF-κB 抑制劑）、SB 203580（p38 抑制劑）和LY 294002（PI3K 抑制劑）處理巨噬細胞后，與B 組比較，E、F、G 組RNF20 蛋白表達、H2Bub/H2B 無明顯改變（P 均＞0.05）；E組NF-κB、IL-6蛋白表達及巨噬細胞遷移數量減少（P均＜0.01）；F、G組NF-κB、IL-6蛋白表達及巨噬細胞遷移數量無明顯改變（P均＞0.05）。結論 RNF20減少，H2Bub減少，加劇 巨噬細胞遷移及炎癥反應，促進 了動脈粥樣硬化的形成，此過 程經NF-κB信號通路起作用。

關鍵詞：動脈粥樣硬化；基因表觀遺傳學；組蛋白泛素化；環指蛋白20；核因子-κB；巨噬細胞遷移

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2022.10.014

中圖分類號：R543.5文獻標志碼：A文章編號：1002-266X（2022）10-0060-04

動脈粥樣硬化（AS）是慢性炎性疾病。巨噬細胞向血管內膜的遷移及炎癥反應是AS 發生的重要環節［1］。基因表觀遺傳學是指基因的表達被調控與修改，但脫氧核糖核酸（DNA）序列卻仍保持原來的狀態，產生可遺傳的變化［2］。組蛋白經翻譯后的泛素化修飾是其重要一員，其錯誤的修飾將導致人體結構與功能異常，從而導致疾病發生［3］。基因表觀遺傳學可能是AS的最新研究熱點［4］。組蛋白是染色質中的重要成分，其含有大量堿性蛋白質，與酸性DNA緊密結合［5］。組蛋白經過泛素化或去泛素化等翻譯后修飾，會影響DNA 損傷修復、基因轉錄調控、細胞周期以及炎癥反應等過程［6］。環指蛋白20（RNF20）是組蛋白H2B泛素化（H2Bub）修飾過程中的泛素化鏈接酶。研究表明，在腫瘤壞死因子α（TNF-α）刺激的人乳腺上皮細胞MCF10A中，RNF20參與H2Bub調控，抑制炎癥相關基因激活［7］。2020年12月―2021年11月，我們通過ox-LDL 刺激構建巨噬細胞炎癥遷移模型，探討RNF20 調控組蛋白H2Bub 修飾經NF-κB 途徑參與巨噬細胞遷移及炎癥反應過程，為AS的預防與治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞系，購自中國豐暉生物技術有限公司；DMEM 培養基、FBS、Hyclone 購自美國Gibco 公司；ox-LDL 購自廣州奕源生物科技有限公司；BCA 試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；SN50（NF-KB 抑制劑）購自上海西格生物有限公司；SB203580（P38 抑制劑）；LY294002（PI3K 抑制劑）購自上海碧云天生物技術有限公司；Transwell 小室購自美國Conring 公司；anti-RNF20 一抗、anti-IL-6 一抗、anti-H2B 一抗、anti-NF-κB 一抗、anti-β-actin 一抗、HRP 標記的羊抗兔抗體均購自美國Abclonal 公司；anti-H2Bub 一抗購自美國CST 公司；RNF20 過表達載體質粒oe-RNF20 及相應的對照質粒pcDNA 購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 巨噬細胞培養 小鼠RAW264.7 巨噬細胞培養于DMEM 培養基中，培養基中含有10%FBS、1%的青鏈霉素，置于溫度37 ℃、含有5%CO2的細胞恒溫箱中培養。當細胞生長狀態良好且密度達到80%左右，用PBS沖洗，胰蛋白酶消化完全后進行傳代，傳至6～10代的RAW264.7巨噬細胞進行后續實驗。

1.3 巨噬細胞轉染 當細胞培養至生長狀態良好且密度達80%左右時，棄含有血清的培養基，用PBS溶液沖洗。用Opti-MEMI 分別將LipofectamineTM3000、oe-RNF20、pcDNA混合均勻后，置于37 ℃培養箱中，6 h 后當細胞轉染率達到80%時，更換細胞培養基，轉染結束后繼續用ox-LDL刺激48 h。

1.4 細胞分組及干預 將細胞隨機分為7 組，A 組（對照組）：培養48 h；B 組（ox-LDL 刺激組）：應用50 mg/mL ox-LDL 刺激48 h；C 組（ox-LDL+oe-RNF20轉染組）：oe-RNF20 轉入巨噬細胞后用50 mg/mL ox-LDL 刺激48 h；D 組（ox-LDL+pcDNA 轉染對照組）：pcDNA 轉入巨噬細胞后用50 mg/mL ox-LDL 刺激48 h；E 組（ox-LDL+SN50 干預組）：應用50 mg/mL的ox-LDL刺激24 h后再給予10μg/mL的SN50處理24 h，共干預48 h；F組（ox-LDL+LY294002干預組）：應用50 mg/mL的ox-LDL刺激24 h后再給予10μg/mL的LY294002處理24 h，共干預48 h；G組（ox-LDL+p38干預組）：應用50 mg/mL的ox-LDL刺激24 h后再給予10μg/mL的p38，共干預48 h，采樣檢測。

1.5 RNF20、H2B、H2Bub、NF-κB、IL-6 蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。提取不同組的細胞蛋白，使用BCA法測量不同組間的蛋白濃度。取30μg的上樣量進行電泳、轉膜，牛奶封閉2 h，加入用TBST 配置好的一抗，4 ℃過夜，洗膜3 次，每次8 min。然后加入用TBST 配置的二抗，在室溫下搖晃40 min，再次洗膜3次，每次8 min。最后使用ECL發光液進行顯色，使用Image J 進行灰度值分析與計算，測量3次后取平均值。

1.6 巨噬遷移能力檢測 采用Transwell 實驗。按照Transwell 說明書，將密度達到50%的巨噬細胞用胰酶消化，制成適量濃度的細胞懸液后，取適量懸液進行計數，在小室下室加含血清培養基，在小室上室加無血清的培養基并將細胞接種于小室上室。將含有細胞的小室培養48 h 后取出，用甲醛對細胞進行固定，結晶紫對細胞染色，PBS 溶液進行清洗。最后清除未穿過小室的細胞，置于顯微鏡觀察并拍照。每組細胞分別接種于3 個小室，平均值即細胞遷移數量。

1.7 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。符合正態分布的計量數據以-x±s表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q法，兩組比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同處理各組巨噬細胞蛋白表達及巨噬細胞遷移變化 見表1。

表1 各組蛋白表達及遷移細胞數比較（-x±s）

2.2 上調RNF20 對巨噬細胞炎癥及遷移影響 與A 組比較，B 組RNF20 蛋白表達減少（P＜0.01），H2Bub/H2B 減小（P＜0.01），NF-κB 和IL-6 蛋白表達增加（P均＜0.01），巨噬細胞遷移數量增多（P＜0.01）；與B 組比較，C 組RNF20 蛋白表達增加（P＜0.01），H2Bub/H2B 增加（P＜0.01），NF-κB、IL-6 蛋白表達減少（P均＜0.01），巨噬細胞遷移數量減少（P＜0.01）；D組RNF20蛋白表達、H2Bub/H2B、NF-κB、IL-6 蛋白表達、巨噬細胞遷移數量與B 組比較差異均無統計學意義（P均＞0.05）。

2.3 RNF20 介導的H2Bub 經NF-κB 途徑對巨噬細胞炎癥及遷移影響 E、F及G 組RNF20蛋白表達與B組比較差異均無統計學意義（P均＞0.05），H2Bub/H2B 差異無統計學意義（P＞0.05），E 組NF-κB、IL-6蛋白表達減少（P均＜0.01），巨噬細胞遷移數量減少（P＜0.01），F、G 組NF-κB、IL-6 蛋白表達差異無統計學意義（P均＞0.05），巨噬細胞遷移數量差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

AS是心腦血管疾病最常見的病理學基礎，其引發的心肌梗死及中風等并發癥是最常見的死因［8］。巨噬細胞是參與AS發病的重要細胞之一，不僅能吞噬脂類物質，促進炎癥細胞因子的分泌，導致AS 斑塊的形成，還能結合活化的內皮細胞并遷移到內膜層，從而加重AS 病變過程［9］。組蛋白泛素化在基因轉錄后的修復過程和調節細胞穩態中扮演重要角色，是基因表觀遺傳學的重要成員［10］。基因表觀遺傳學已成為AS 新的研究領域［4］，AS 除了與脂質沉積、炎癥反應等有關外，基因表觀遺傳學也參與其中［11］。

本研究觀察發現，在ox-LDL 刺激的巨噬細胞中，與對照細胞相比，ox-LDL 巨噬細胞遷移數目增多，且伴有RNF20 和H2Bub 的降低，提示在AS 形成過程中，組蛋白泛素化酶RNF20 減少，使H2Bub 表達減少，經組蛋白修飾表觀遺傳學促進巨噬細胞遷移。研究表明，RNF20 調控H2Bub 影響慢性炎癥及癌癥進展，如在肺癌和卵巢癌中RNF20 及H2Bub 表達降低［12-13］，與本實驗結果相似。

基因表觀遺傳學研究內容主要包含DNA 甲基化和組蛋白修飾等［14］。組蛋白是真核生物染色體的結構蛋白，分為組蛋白H1（H1）、組蛋白H2A（H2A）、組蛋白H2B（H2B）、組蛋白H3（H3）和組蛋白H4（H4）五種。真核細胞中的DNA 以染色質的形式存在，染色質的基本組成單位是核小體，核小體由8個核心組蛋白（兩個H2A、H2B、H3、H4）和145～147個DNA 堿基對組成，H1 結合于核小體之間的連接DNA 上，使核小體緊密相連［15］。核小體中的核心處于比較穩定的狀態，組蛋白的C 末端和N 末端可伸展到核小體外，發生泛素化等修飾［16］。組蛋白經過泛素化修飾后使染色質的結構改變，影響了其與下游蛋白的相互作用，此外還可與甲基化及乙酰化等修飾協同作用，共同調控人體精細的生命活動［17］。本研究發現，ox-LDL 刺激的巨噬細胞中RNF20 及H2Bub 表達降低，這提示RNF20 可能修改H2Bub 修飾基因表觀遺傳學從而影響ox-LDL 刺激的巨噬細胞遷移。本研究結果表明，在過表達RNF20 后，H2Bub 表達增加，NF-κB 和IL-6 表達被抑制，且巨噬細胞遷移數量減少，提示RNF20 可影響組蛋白H2Bub 基因表觀遺傳學，從而對巨噬細胞遷移及炎癥因子進行調控。

此外本實驗發現，在ox-LDL 刺激的巨噬細胞中NF-κB 和IL-6 表達增加。本實驗進一步在ox-LDL的巨噬細胞炎癥遷移模型中，加入多種炎癥通路的特異性抑制劑。結果顯示RNF20 及H2Bub 表達量無明顯改變，在加入NF-κB 通路抑制劑SN50 后，IL-6 表達下降且伴有巨噬細胞遷移數量減少，而在加入SB203580（p38 通路抑制劑）和LY294002（PI3K通路抑制劑）并未觀察到這種改變。說明NF-κB 是H2Bub修飾基因表觀遺傳學參與巨噬細胞炎癥反應及巨噬細胞遷移的必經途徑。NF-κB 是核轉錄因子，在免疫調節、炎癥反應中發揮重要作用［18］。NFκB 在正常血管中含量極低，在AS 中的巨噬細胞中NF-κB 含量明顯增高，表明NF-κB 參與AS 的調控［19］。NF-κB 信號通路能夠活化TNF-α、IL-6、IL-8等細胞炎性因子的表達從而加重炎癥反應［20］。

綜上所述，組蛋白的泛素化作為基因表觀遺傳學的重要組成部分調控巨噬細胞炎癥及遷移反應，進而影響AS 的形成和發展。當RNF20 減少時，H2Bub減少，可促進巨噬細胞遷移及炎癥因子表達，從而促發AS 進展，此過程經過NF-κB 途徑發揮作用。