視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞伴發(fā)黃斑水腫患者房水中miR-191、p21表達(dá)及意義

劉法，郝靜，陳志杰

哈爾濱二四二醫(yī)院眼三科，哈爾濱150042

摘要：目的 探究視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞（CRVO）伴發(fā)黃斑水腫患者房水中miR-191和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1（p21）表達(dá)及意義。方法 選取CRVO伴發(fā)黃斑水腫患者42例（42只眼）為研究對象（CRVO組），另選 取同期因白內(nèi)障行超聲乳化白內(nèi)障吸除術(shù)患者38 例（38 只眼）作為對照組。分別采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法和ELISA 法檢測CRVO 伴發(fā)黃斑水腫患者房水中miR-191、p21 mRNA 及蛋白表達(dá)，采用 Logistic 回歸模型分析二者與CRVO伴發(fā)黃斑水腫患者臨床特征及視力預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 CRVO組房水中miR-191、p21 mRNA及蛋白表達(dá)均低于對照組（P 均＜0.05）。CRVO 伴發(fā)黃斑水腫患者房水中miR-191 與p21 mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.492，P＜0.05）。CRVO伴發(fā)黃斑水腫患者房水中miR-191、p21 mRNA表達(dá)與CMT均呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.500、-0.432，P均＜0.05）。雷珠單抗注射次數(shù)＞4.67、缺血型、合并患有高血壓、基線最佳矯正視力低水平、預(yù)后視力提高≤0.2 CRVO 患者房水中miR-191和p21 mRNA表達(dá)分別低于雷珠單抗注射次數(shù)≤4.67、非缺血型、未合并患有高血壓、基線最佳矯正視力高水平、預(yù)后視力提高＞0.2 CRVO 患者（P 均＜0.05）。高血壓、雷珠單抗注射次數(shù)＞4.67、缺血型、基線最佳矯正視力≤0.24、miR-191低水平是影響CRVO伴發(fā)黃斑水腫患者預(yù)后視力提高的獨立危險因素（P均＜0.05）。結(jié)論 CRVO伴發(fā)黃斑水腫患者房水中miR-191、p21 mRNA 及蛋白表達(dá)均降低，二者 與患者預(yù)后視力提高有關(guān)；二者可能協(xié)同參與CRVO伴發(fā)黃斑水腫發(fā)生發(fā)展。

關(guān)鍵詞：視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞；黃斑水腫；微小RNA-191；細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2022.10.020

中圖分類號：R774.1文獻標(biāo)志碼：A文章編號：1002-266X（2022）10-0080-04

視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞（CRVO）是一種常見的眼底血管性疾病，對患者視力損害嚴(yán)重。CRVO 多發(fā)于中老年人群，且隨年齡增長發(fā)病率逐漸升高［1］。CRVO 發(fā)生后血液回流障礙導(dǎo)致視網(wǎng)膜出現(xiàn)大量無灌注區(qū)，引起黃斑水腫，是導(dǎo)致CRVO 患者視力損害的主要原因［2］。NAELI 等［3］研究證實，miR-191 可通過調(diào)控靶向基因在心血管疾病中發(fā)揮重要作用。ZHANG 等［4］研究發(fā)現(xiàn)，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞感染甲型流感病毒后miR-191 表達(dá)降低，與細(xì)胞通透性增加有關(guān)。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1（p21）是細(xì)胞周期重要負(fù)調(diào)控因子，有抗血管生成作用。邱梅園等［5］研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)p21表達(dá)可使視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞阻滯于S期，抑制細(xì)胞增殖。研究表明，上調(diào)p21 表達(dá)可抑制高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性［6］。而GU 等［7］研究表明，miR-191 是血管生成的有效抑制劑，上調(diào)miR-191 表達(dá)可促進p21 表達(dá)，影響新生血管形成。2017 年6 月—2019 年6 月，我們選取42 例CRVO 伴發(fā)黃斑水腫患者，探討房水中miR-191、p21表達(dá)及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017 年6 月—2019 年6 月本院收治的CRVO 伴發(fā)黃斑水腫患者42 例（42 眼）為研究對象（CRVO 組），其中男25 例（25 眼）、女17 例（17 眼），年齡（58.47± 18.73）歲。高血壓27 例，病程（2.61±0.89）個月。光學(xué)相干斷層掃描（OCT）檢查黃斑中央凹視網(wǎng)膜厚度（CMT）為（597.31 ±176.05）μm，基線最佳矯正視力0.24±0.11。缺血型CRVO 患者20 例，非缺血型CRVO 患者22 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)眼底檢查、熒光造影、OCT 檢查，確診為CRVO伴發(fā)黃斑水腫［8-9］；②初次發(fā)病，無治療史和眼內(nèi)手術(shù)史；③需行睫狀體平坦部玻璃體腔藥物注射治療；④病程＞1 個月，能配合本研究，且臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并青光眼、眼內(nèi)炎癥、新生血管性疾病其他眼部疾??；②合并惡性腫瘤患者；③合并糖尿病者；④心、腎、肝臟功能嚴(yán)重不足者。另選取同期因白內(nèi)障行超聲乳化白內(nèi)障吸除術(shù)患者38 例（38眼）作為對照組，排除標(biāo)準(zhǔn)與CRVO 組患者一致，對照組男24 例、女14 例，年齡（59.15±19.43）歲。高血壓21 例。OCT 檢查CMT 為（183.19±21.54）μm，基線最佳矯正視力0.22 ± 0.12。所有入組者對本研究知情并簽署知情同意書。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2 CRVO 伴發(fā)黃斑水腫患者房水中miR-191、p21 mRNA 表達(dá)檢測 入組CRVO 患者在表面麻醉和結(jié)膜囊清潔消毒后、行玻璃體腔藥物注射治療前，采用注射器針頭行前房穿刺，抽取房水100 μL，置于離心管后保存于-80 ℃冰箱。入組白內(nèi)障患者行超聲乳化白內(nèi)障吸除術(shù)前行前房穿刺，抽取房水100 μL，置于離心管后保存于-80 ℃冰箱。采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測CRVO 伴發(fā)黃斑水腫患者房水中miR-191、p21 mRNA 表達(dá)。TRIzol 法提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后用于RT-qPCR 擴增。miR-191正向引物5'-CTCTTTGGCATGGCCAATAC-3'，反向引物5'-GGTAGCTACCATGGCCCATC-3'；p21 mRNA 正向引物5'-CACTCCCAATCGGTAGGTAC-3'，反向引物5'-AATGGCAGGGCTAGGGCTGG-3'；U6 正向引物5'-GGGAGGTATGTGACTACACA-3'，反向引物5'-CAGGCCCACAGACTCATTAA-3'；GAPDH 正向引物5'-GGCATCCAGCAGCTCGATGC-3'，反向引物5' -GGACGTAACGTACGAGTAAT-3'。 反應(yīng)體系為20 μL：cDNA 2 μL，正反向引物各2 μL，SYBR?Primix 10μL，ROX 0.4μL，ddH2O 3.6μL。反應(yīng)步驟：95 ℃、8 min，1循環(huán)；95 ℃、15 s，62 ℃、38 s，72 ℃、15 s，以上40 個循環(huán)，1 個樣品重復(fù)3 次。2-ΔΔCT法計算miR-191、p21 mRNA表達(dá)。

1.3 CRVO伴發(fā)黃斑水腫患者房水中p21蛋白表達(dá)檢測 采用ELISA 法檢測CRVO 組及對照組房水中p21 蛋白表達(dá)。按照人p21 蛋白ELISA 試劑盒說明書配制一系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品，在450 nm 波長下，利用YT-MB96A 酶標(biāo)儀檢測不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的OD 值，繪制p21 蛋白的標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線，并利用回歸曲線計算房水中p21蛋白表達(dá)。

1.4 隨訪 患者行雷珠單抗注射治療出院后12 個月，以復(fù)查形式對其進行隨訪，檢測并記錄患者最佳矯正視力。隨訪期間入組42 只眼注射次數(shù)1～9（4.67±2.05）次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料符合正態(tài)分布以xˉ±s表示，比較行t檢驗；計數(shù)資料比較行χ2檢驗；采用Logistic 回歸模型進行多因素分析，選擇向前（LR）剔除法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRVO 組與對照組房水中miR-191 和p21 mRNA及蛋白表達(dá)比較 見表1。

表1 CRVO組與對照組房水中miR-191和p21表達(dá)比較（-x±s）

2.2 CRVO 伴發(fā)黃斑水腫患者房水中miR-191、p21 mRNA 表達(dá)與CMT 的相關(guān)性 CRVO 伴發(fā)黃斑水腫患者房水中miR-191 與p21 mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.492，P＜0.05）。CRVO 伴發(fā)黃斑水腫患者房水中miR-191、p21 mRNA 表達(dá)與CMT 均呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.500、-0.432，P均＜0.05）。

2.3 CRVO 伴發(fā)黃斑水腫患者房水中miR-191 和p21 表達(dá)與臨床特征及預(yù)后關(guān)系 以平均值為界，比較各指標(biāo)不同水平患者房水中miR-191 和p21 mRNA 表達(dá)差異［10］。不同性別、年齡（以平均值為界分組）、病程（以平均值為界分組）CRVO 伴發(fā)黃斑水腫患者房水中miR-191和p21 mRNA表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。雷珠單抗注射次數(shù)＞4.67（以平均值為界分組）、缺血型、合并患有高血壓、基線最佳矯正視力低水平（以平均值為界分組）、預(yù)后視力提高≤0.2 CRVO 患者房水中miR-191和p21 mRNA 表達(dá)分別低于雷珠單抗注射次數(shù)≤4.67、非缺血型、未合并患有高血壓、基線最佳矯正視力高水平、預(yù)后視力提高＞0.2 CRVO 患者（P均＜0.05），見表2。

2.4 影響CRVO 伴發(fā)黃斑水腫患者預(yù)后視力提高的危險因素分析 以本研究資料為樣本，以預(yù)后視力提高水平（≤0.2 為1，＞0.2 為0）為因變量建立Logistic回歸模型。以表2中P＜0.05的因素/指標(biāo)為自變量，選取是否合并高血壓、雷珠單抗注射次數(shù)、是否為缺血型、基線最佳矯正視力、miR-191 表達(dá)水平等5 個因素為自變量。結(jié)果如表3 所示，高血壓、雷珠單抗注射次數(shù)＞4.67、缺血型、基線最佳矯正視力≤0.24、miR-191 低水平是影響CRVO 伴發(fā)黃斑水腫患者預(yù)后視力提高的獨立危險因素（P均＜0.05）。

表2 房水中miR-191和p21表達(dá)與CRVO患者臨床特征的關(guān)系

表3 影響CRVO伴發(fā)黃斑水腫患者預(yù)后視力提高的危險因素

3 討論

研究表明，CRVO 可引起視網(wǎng)膜血管功能障礙，導(dǎo)致毛細(xì)血管缺血、缺氧及血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，通過引發(fā)血—視網(wǎng)膜屏障損壞造成血管通透性增加和血管滲漏，是CRVO并發(fā)黃斑水腫的主要原因［2］。

DU 等［11］研究報道，miR-191 在急性缺血性腦卒中患者血漿、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、大腦中動脈閉塞大鼠血漿及大腦中升高，過表達(dá)miR-191 可促進人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，通過抑制血管生成促進缺血性腦損傷形成。研究發(fā)現(xiàn)，體外過表達(dá)miR-191 可抑制人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)肺血管收縮和結(jié)構(gòu)重建，參與肺動脈高壓發(fā)生、發(fā)展［12］。本研究結(jié)果顯示，CRVO 組患者房水中miR-191 表達(dá)均低于對照組，提示房水中miR-191 低表達(dá)可能與CRVO 伴發(fā)黃斑水腫發(fā)生有關(guān)，可能通過影響視網(wǎng)膜血管生成和通透性改變，促進CRVO 伴黃斑水腫發(fā)生。有研究表明，miR-191 在頸動脈損傷14 d 后可抑制內(nèi)膜增厚，控制血管損傷后新生內(nèi)膜形成［13］。本研究結(jié)果顯示，CRVO 組房水中miR-191 表達(dá)與CMT 呈負(fù)相關(guān)，提示miR-191 表達(dá)降低可能與CRVO 伴發(fā)黃斑水腫患者CMT增加有關(guān)。

研究表明，缺血型、有高血壓史、基線視力差（＜0.1）的CRVO 患者預(yù)后視力恢復(fù)明顯較差［14-15］。TENORIO等［16］研究表明，行腹主動脈瘤血管修復(fù)術(shù)患者術(shù)前miR-191表達(dá)上調(diào)，術(shù)后6個月表達(dá)降低。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血型、合并患有高血壓、基線最佳矯正視力低水平、預(yù)后視力提高≤0.2 CRVO 組房水中miR-191表達(dá)低于非缺血型、未合并患有高血壓、基線最佳矯正視力高水平、預(yù)后視力提高＞0.2 CRVO組患者，提示miR-191低水平可能通過影響缺血型CRVO、高血壓、基線最佳矯正視力低水平發(fā)生，參與CRVO 伴發(fā)黃斑水腫進展，影響患者視力預(yù)后提高。

p21 是一種細(xì)胞周期抑制蛋白，在細(xì)胞周期系統(tǒng)中起負(fù)性調(diào)控作用。KE等［17］研究報道，體內(nèi)外氧化應(yīng)激增加可通過誘導(dǎo)p21 表達(dá)，促進人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老并減少增殖。SRINIVASA 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)p21 表達(dá)可抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和新生內(nèi)膜形成。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，CRVO組患者房水中p21 mRNA及蛋白表達(dá)降低，且與CMT 呈負(fù)相關(guān)，提示p21 mRNA 及蛋白表達(dá)下調(diào)可能與CRVO 伴黃斑水腫發(fā)生和CMT 密切相關(guān)。p21 低表達(dá)可能通過減少對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制，促進CRVO 患者視網(wǎng)膜血管生成和血管滲漏發(fā)生，引起黃斑水腫。本研究還發(fā)現(xiàn)，CRVO 組患者p21 mRNA 表達(dá)與是否為缺血型、是否合并患有高血壓及基線最佳矯正視力有關(guān)，進一步提示p21 mRNA 低表達(dá)與CRVO 伴黃斑水腫發(fā)生有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，股淺動脈閉塞患者行血管成形術(shù)后p21表達(dá)水平明顯下調(diào)，與血管平滑肌細(xì)胞增殖密切相關(guān)［19］。本研究結(jié)果顯示，預(yù)后視力提高≤0.2 CRVO組患者房水中p21 mRNA 表達(dá)均低于預(yù)后視力提高＞0.2 CRVO 組患者，提示p21 mRNA 低表達(dá)可能預(yù)示CRVO伴黃斑水腫預(yù)后視力改善水平低。

本研究發(fā)現(xiàn)，CRVO 伴發(fā)黃斑水腫患者房水中miR-191 與p21 mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)。提示miR-191 與p21 在參與CRVO 伴黃斑水腫發(fā)生發(fā)展中可能起協(xié)同作用，但具體機制尚需進一步探究。本研究還發(fā)現(xiàn)，高血壓、雷珠單抗注射次數(shù)＞4.67、缺血型、基線最佳矯正視力≤0.24、miR-191 低水平是影響CRVO 伴發(fā)黃斑水腫患者預(yù)后視力提高的獨立危險因素。進一步提示miR-191 與p21 表達(dá)可能與CRVO伴發(fā)黃斑水腫患者預(yù)后視力提高密切相關(guān)。

綜上所述，CRVO 伴黃斑水腫患者房水中miR-191、p21 mRNA 及蛋白表達(dá)降低，與患者是否為缺血型、是否合并高血壓、基線最佳矯正視力水平及預(yù)后視力提高有關(guān)，二者可能協(xié)同參與CRVO 伴發(fā)黃斑水腫發(fā)生、發(fā)展。