不同負ORP值堿性電解水理化、抗氧化及緩解胃酸性能研究

夏 瑞 鐘 耕 李 恬 楊萬富 高羽歌

(西南大學食品科學學院，重慶 400000)

自由基過多會導致機體氧化應激損傷[1-2]。近年來，清除自由基，提高機體抗氧化能力成為預防和治療疾病的著眼點。隨著抗氧化劑的應用，發現一些化學合成抗氧化劑存在副作用[3]。因此，尋求天然抗氧化劑，通過飲食調節清除自由基成為研究熱點[4]。

堿性電解水(alkaline electrolyzed water，AEW)是飲用水或電解質水經電解后在陰極生成的高負氧化還原電位堿性水[5-6]。氧化還原電位(oxidation-reduction potential，ORP)作為水溶液獲得或失去電子的趨勢，反映出體系的氧化—還原性(電位為正，為氧化性；電位為負，為還原性)[7]。Shirahata等[8]發現，還原電位越低(負ORP值越大)，其給電子能力越強，與過氧自由基結合能力越強。研究[9-10]表明，AEW可以抑制脂質過氧化，緩解氧化應激損傷。因此具有開發成為天然抗氧化功能飲料的潛力[11]。目前關于電解水的研究主要集中于應用方面[12-13]，迄今未見對不同負ORP值AEW抗氧化活性比較研究報道。

胃酸過多通常是吸煙飲酒、飲食不當等不良生活習慣導致，會造成機體產生胸胃灼痛、嘔吐等不良反應，嚴重者還會引起其他腸胃疾病[14]。用于治療胃酸過多的藥物包括能減少胃酸分泌的抑酸藥，如奧美拉唑；中和胃酸的抗酸藥，如碳酸氫鈉。這些藥物療效雖好但有較嚴重的副反應，不能長期服用[15]。堿性電解水pH呈弱堿性，符合飲用水標準，可作為天然抗酸劑[16-17]。目前，關于AEW緩解胃酸過多癥的研究還未見報道。

試驗擬以生活飲用水為對照，開展不同負ORP值AEW抗氧化以及中和胃酸過多能力的研究，探究AEW負ORP值與pH值對應關系以及負ORP值和pH值與AEW抗氧化和中和胃酸能力的關系，旨在為新型飲品的開發和功能探索提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

雄性昆明小鼠：SPF級，許可證號為SCXK(湘)2019-0004，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司；

抗壞血酸、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)：北京索萊寶科技有限公司；

胃蛋白酶：活性3 200～4 500 U/mg，北京索萊寶科技有限公司；

其他試劑均為國產分析純；

試驗用水均為超純水。

1.1.2 主要儀器設備

紫外可見分光光度計：759型，上海菁華科技儀器有限公司；

電解水機：XK-A7型，廣東新康科技有限公司；

pH/ORP計：pHS-3C型，上海儀電科學儀器股份有限公司；

電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS)：Agilent7700X型，美國安捷倫科技有限公司；

高速分散器：XHF-DY型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

離心機：Eppendorf Centrifuge 5804 R型，德國艾本德科學公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 堿性電解水制備 使用電解水機電解生活飲用水制得不同負ORP值電解水(水樣1、水樣2、水樣3)。

1.2.2 水質理化指標測定 參照GB/T 5750—2006《生活飲用水標準檢驗方法》，檢測水樣水質指標。檢測指標包括：pH值、TDS值、ORP值(采用pH/ORP計測定)，電解水中的礦物質元素采用ICP-MS法檢測。各組試驗平行測定3次。

1.2.3 抗氧化能力測定 以生活飲用水作比較，測定不同負ORP值AEW水樣1、2、3體外抗氧化活性。

(1)超氧陰離子自由基清除率：參考Saad等[18]的方法，稍作調整。取pH 8.2 Tris-HCl緩沖溶液5 mL于具塞試管中，(25.0±0.5)℃水浴預熱20 min，依次加入樣品溶液2 mL 和0.5 mL濃度5.00×10-3mol/L鄰苯三酚溶液(1.0×10-2mol/L HCl溶液配制)，搖勻，25 ℃水浴4 min，320 nm處測定其吸光度A1；超純水2 mL代替上述樣品溶液，測定吸光度A0；以1.0×10-2mol/L HCl參比溶液0.5 mL代替鄰苯三酚溶液，測定吸光度A2。按式(1)計算超氧陰離子自由基清除率。

(1)

式中：

S——自由基清除率，%；

A0——空白組吸光度值；

A1——試驗組吸光度值；

A2——對照組吸光度值。

以維生素C為標品，得到維生素C質量濃度x(μg/mL)與超氧陰離子自由基清除率y(%)標準曲線方程為y=0.007 1x+0.028 8，R2=0.999 2，樣品的超氧陰離子清除率結果以維生素C當量表示(μg維生素C/mL)。

(2)羥自由基清除率：參考Hui等[19]的方法并稍作修改。取2.0 mL樣品液，依次加入9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L水楊酸乙醇溶液和8.8 mmol/L H2O2溶液各2.0 mL，37 ℃水浴30 min。用同體積超純水代替樣品液作空白組，用同體積超純水代H2O2溶液作對照，510 nm 處測量吸光度值。按式(1)計算羥自由基清除率。

以維生素C為標品，得到維生素C質量濃度x(μg/mL)與羥自由基清除率y(%)標準曲線方程為y=0.098 8x+0.319 2，R2=0.999 2，樣品的羥自由基清除率結果以維生素C當量表示(μg維生素C/mL)。

(3)ABTS自由基清除率：參考Ayseli等[20]的方法，略作調整。4 mL樣品液與4 mL 0.1 mmol/L ABTS+溶液混合，劇烈震搖，避光放置10 min，734 nm處測定其吸光度，用超純水溶液代替樣品作對照。按式(2)計算ABTS自由基清除率。

(2)

式中：

S——ABTS自由基清除率，%；

A0——對照組吸光度；

A1——試驗組吸光度。

以維生素C為標品，得到維生素C質量濃度x(μg/mL)與ABTS自由基清除率y(%)標準曲線方程為y=0.067 9x+0.017 1，R2=0.999 5。樣品ABTS自由基清除率結果以維生素C當量表示(μg維生素C/mL)。

(4)抑制Fe2+-H2O2誘導小鼠肝勻漿脂質過氧化能力(丙二醛抑制率)：參考陳思南等[21]的方法，略加修改。小鼠適應性喂養1周，頸椎脫臼法處死，取新鮮肝臟用預冷生理鹽水沖洗后加入超純水，高速分散器3 000 r/min勻漿5 min，制成質量分數5%肝勻漿待用。4 ℃、3 000 r/min 離心15 min，取1.0 mL肝勻漿上清液于樣品管，加入0.5 mL樣品液，混勻，37 ℃水浴10 min，加入0.5 mL 6 mmol/L FeSO4溶液和40 μL 60 mmol/L H2O2溶液作誘導劑，模型管不加樣品溶液，空白管不加誘導劑，將模型管、空白管和樣品管置于37 ℃水浴1 h。再冰浴10 min終止反應。向各管加入體積分數15%三氯乙酸1.0 mL和0.67%硫代巴比妥酸1 mL，混勻，置于100 ℃ 水浴15 min，自來水冷卻，6 000 r/min離心10 min，取上清液于532 nm處測吸光度。按式(3)計算丙二醛抑制率。

(3)

式中：

R——抑制率，%；

A模型、A空白、A樣品——模型管、空白管、樣品管吸光度。

1.2.4 體外模擬緩解胃酸過多能力測定 參考文獻[22-23]稍作修改。

(1)人工胃液的配置：將氯化鈉(2 g)和胃蛋白酶(3.2 mg)溶解于500 mL超純水，加入鹽酸(7 mL)用超純水定容成1 000 mL，定容后調節pH至1.2。

(2)不同負ORP值AEW對人工胃液H+的消耗：取上述人工胃液200 mL，加熱保持溶液溫度在(37.0±0.5)℃，加入飲用水、水樣1、水樣2、水樣3以及0.2 g/100 mL 碳酸氫鈉溶液90 mL作對照，100 r/min搖床反應5，10，30 min時依次取出，吸取溶液5 mL用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取濾液用于下述測定。

(3)胃酸消耗量測定：將上述濾液置于錐形瓶，以1 g/L 酚紅作指示劑，用0.01 mol/L氫氧化鈉滴定，測定H+濃度，表征胃酸消耗量，按式(4)計算胃酸消耗量。

(4)

式中：

I——胃酸消耗量，mmol/L；

V人工胃液——人工胃液體積，200 mL；

VNaOH——消耗氫氧化鈉體積，mL。

1.3 數據處理

采用Excel 2016進行統計分析，結果以“平均值±標準差”表示，SPSSS 26.0軟件進行統計學分析，通過Spearman法進行相關性分析，Duncan法進行多組間顯著性分析，采用Origin 2019制圖。

2 結果與分析

2.1 堿性電解水水質

2.1.1 pH、ORP和TDS值 由表1可以看出，電解生活飲用水產生水樣1、2的pH值符合相關企業標準，如Q/TZYP 0001S—2019《蘇打水飲料》和Q/LBJX 0002S—2019《蘇打水飲料》。國產的不論是人工調配還是天然蘇打水，各類標準中，其pH值均要求不得超過9。水樣3 pH過高不符合標準，后續試驗將其作為對照研究不同負ORP值AEW抗氧化和緩解胃酸能力。AEW的負ORP值則隨水樣的pH值增大而逐漸增大，通過對表1 AEW負ORP值與pH值相關性分析，表明其呈極顯著正相關(P<0.01)。有研究[24]報道飲用ORP值低(即負ORP值大)的水，可以降低機體內氧化性物質的含量及其活性，提高抗氧化酶的活性，有益于人體健康。尹軍等[25]提出ORP<200 mV可作為健康飲用水標準之一。由表1可知，AEW水樣1、2、3的ORP值為負值，顯著低于200 mV(P<0.05)，飲用水的ORP為正值(353 mV)，且顯著高于200 mV(P<0.05)，說明AEW符合健康飲用水標準。濃度為0.01 mol/L的NaOH溶液，其pH值為11.85，為強堿性溶液，但其ORP值為正值(286 mV)；質量分數為0.2%的NaHCO3溶液，其pH為8.96，為堿性溶液，ORP值為正值(273 mV)，均顯著高于200 mV(P<0.05)，說明人工調制的堿性水不具有抗氧化性能，負ORP值為AEW的特點。

表1 不同水樣水質指標?Table 1 Indexes of different water quality

2.1.2 堿性電解水主要礦物質元素 由表2可知，AEW水樣1、2、3主要礦物質元素含量符合飲用水標準GB 5749—2006《生活飲用水衛生標準》且3種水樣無顯著性差異，表明電解原料相同不同負ORP值對AEW礦物質含量無顯著影響，與蔡懷彧[6]對AEW制備條件與礦物質含量關系影響研究結果一致。3種水樣中礦物質含量以鈣含量最高，其次是鈉和鎂，可能與飲用水中礦物質含量高低有關。

表2 不同水樣主要礦物質元素含量?Table 2 Content of main mineral elements in different water mg/L

2.2 堿性電解水體外抗氧化能力

2.2.1 超氧陰離子自由基清除率 由圖1可知，不同負ORP值AEW對超氧陰離子自由基清除能力由大到小為水樣3>水樣2>水樣1，且顯著高于未電解飲用水(P<0.01)。其中水樣3對超氧陰離子自由基清除作用最強，其維生素C當量為(53.25±0.76)μg維生素C/mL。飲用水對超氧陰離子自由基具有微弱的清除能力，與陳榮河等[26]的研究結果一致，推測可能與飲用水中的無機成分含量有關。對比表2可知，不同負ORP值AEW主要礦物質含量除鈣、鉀、鎂顯著低于飲用水外，其他與飲用水相比無顯著性差異。但不同負ORP值AEW對超氧陰離子自由基清除能力大小顯著高于飲用水(P<0.01)，說明AEW中的無機成分對其抗氧化作用無顯著影響，AEW抗氧化作用的主要原因是其負ORP值所致。通過對AEW負ORP值與超氧陰離子自由基清除能力相關性分析表明AEW負ORP值與超氧陰離子自由基清除能力呈正相關。說明負ORP值AEW可以清除超氧陰離子等氧自由基，具有一定抗氧化性，且AEW抗氧化能力增強與ORP值大小相關。這與Shirahata等[8]發現AEW可以清除活性氧，保護DAN免受氧化損傷的研究結果一致。

小寫字母不同表示具有顯著性差異(P<0.05)圖1 不同水樣的超氧陰離子自由基清除能力Figure 1 Superoxide anion radical scavenging ability of different water samples

2.2.2 羥自由基清除率 由圖2可知，AEW水樣3對羥自由基清除作用最強，水樣2次之，水樣1最低，飲用水對羥自由基無清除作用。對AEW負ORP值與羥自由基清除能力進行相關性分析，表明AEW負ORP值與羥自由基清除能力呈正相關。對比相關研究報道，Hu等[27]發現AEW能夠緩解大鼠因活性氧(超氧陰離子自由基，OH自由基)引起的氧化應激損傷，表現出一定的抗氧化性，與試驗結果相似。

小寫字母不同表示具有顯著性差異(P<0.05)圖2 不同水樣的羥自由基清除能力Figure 2 Hydroxyl radical scavenging ability of different water samples

2.2.3 ABTS自由基清除率 由圖3可知，不同負ORP值AEW對ABTS自由基清除率為水樣3>水樣2>水樣1，各組間結果統計學差異顯著(P<0.05)，且均顯著高于飲用水(P<0.05)。飲用水對ABTS自由基具有一定的清除作用，與盧嬋[7]對3種飲用水抗氧化功能的研究結果一致。相關性分析表明AEW ABTS自由基清除率與其負ORP值呈正相關。負ORP值AEW具抗氧化活性。Kim等[28]研究發現AEW可以通過清除自由基緩解小鼠氧化應激損失，與試驗結果相似。

小寫字母不同表示具有顯著性差異(P<0.05)圖3 不同水樣的ABTS自由基清除能力Figure 3 ABTS free radical scavenging ability of different water samples

2.2.4 對Fe2+-H2O2誘導的肝勻漿脂質過氧化作用的影響 由圖4可知，不同負ORP值AEW水樣均能明顯抑制肝勻漿體系MDA生成，而飲用水對MDA的生成無抑制作用。其中，水樣3對肝勻漿過氧化作用抑制率顯著高于水樣2以及水樣1(P<0.05)，說明不同負ORP值AEW表現出一定的抗脂質過氧化性。相關性分析表明AEW對MDA生成的抑制率與其負ORP值呈極顯著正相關(P<0.01)。劉秋芳等[10]發現AEW可使D-半乳糖所致的小鼠肝、腎、腦組織MDA的生成量下降，與試驗結果相似，但其只使用了一種AEW，未對不同負ORP值AEW進行比較研究。

4種抗氧化指標結果表明，不同負ORP值AEW具有抗氧化性，且表現出較強的超氧陰離子自由基清除能力，自由基清除率大小與AEW負氧化還原電位大小相對應。研究[8]發現，還原電位越低(負ORP值越大)，其供電子能力越強，與過氧自由基結合能力就越強，因此含較高負ORP的物質表現出較強抗氧化作用。不同負ORP值AEW對Fe2+-H2O2誘導肝勻漿體系MDA生成的抑制率隨負ORP值增大而增強。綜上，不同負ORP值AEW表現出抗氧化活性以及抗脂質過氧化作用。

2.3 堿性電解水負氧化還原電位與抗氧化指標相關性分析

AEW負ORP值與ABTS自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率、羥自由基清除率以及MDA抑制率相關性分析見表3。結果表明，AEW負ORP值與4種抗氧化指標呈極顯著正相關(P<0.01)，負ORP值與ABTS自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率、羥自由基清除率以及MDA抑制率相關系數分別為0.965(P<0.01)，0.962(P<0.01)，0.920(P<0.01)，0.998(P<0.01)。說明AEW負ORP值與其抗氧化能力存在顯著相關性，即負ORP值是AEW抗氧化能力的主要原因，負ORP值越大其抗氧化能力越強。

表3 不同負ORP值堿性電解水負ORP值與抗氧化活性的相關性分析?Table 3 Correlation analysis between ORP value and antioxidant activity of different alkaline electrolyzed water

小寫字母不同表示具有顯著性差異(P<0.05)圖4 不同水樣對Fe2+-H2O2誘導肝勻漿脂質過氧化作用的影響Figure 4 Effect of different water samples on lipid peroxidation of liver homogenate induced by Fe2+-H2O2

2.4 對體外人工胃酸過多的緩解作用

由圖5可知，不同負ORP值AEW在人工胃液中反應5 min，對體外人工胃酸中和能力均顯著高于飲用水，水樣3顯著高于水樣2與水樣1。與0.2% NaHCO3相比，水樣2與其對體外人工胃酸中和能力相當，水樣1低于0.2% NaHCO3，水樣3高于0.2% NaHCO3。反應時間延長至10，30 min，AEW對人工胃液中和作用未減弱，依然維持最初水平，水樣2與0.2% NaHCO3效果相同。因此，不同負ORP值AEW與飲用水相比具有中和胃酸能力，而飲用水作為一種溶劑，對胃酸有一定稀釋作用[22]。NaHCO3作為一種抗酸劑，常用于治療胃酸過多癥，但長期服用會導致胃腸脹氣、腹瀉和便秘，鈉攝入過多易誘發高血壓[22,29]。AEW水樣2中和胃酸效果與0.2% NaHCO3相當，說明AEW可以作為一種天然抗酸劑，是安全緩解胃酸過多癥的替代方法。通過對AEW pH值和胃酸消耗量的相關性分析表明AEW中和胃酸能力與pH值呈顯著正相關(P<0.01)。Panda等[22]研究發現較高堿度的植物食品表現出較強的緩解胃酸過多能力，說明pH與緩解胃酸能力相關，與試驗結果一致。

小寫字母不同表示具有顯著性差異(P<0.05)圖5 不同水樣對人工胃酸的體外中和能力Figure 5 The neutralization ability of different water samples to artificial gastric acid in vitro

3 結論

試驗表明不同負氧化還原電位值堿性電解水1、2基本理化指標符合國內蘇打水相關飲用標準，堿性電解水具有抗氧化以及緩解胃酸過多的能力，負氧化還原電位值是堿性電解水具有抗氧化能力機理所在。比較得出水樣2具有較強抗氧化能力，其超氧陰離子自由基、羥自由基、ABTS自由基清除能力分別為(49.06±0.16)，(1.46±0.03)，(3.04±0.08)μg維生素C/mL，MDA抑制率為(20.40±1.56)%，緩解胃酸能力與0.2% NaHCO3相當?？砷_發為具有抗氧化和緩解胃酸作用的功能性飲用水，為消費者在飲用水健康需求方面提供新選擇。后續可進一步對堿性電解水其他功能性質及負氧化還原電位值不同對其他功能性質的影響進行研究。