大鯢肝茶葉水提液脫腥過程中揮發性有機物的動態變化

劉俊霞 趙 萍 萬小輝 別玲玲 金文剛,3

(1. 陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001；2. 陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723001；3. 陜西理工大學大鯢研究所，陜西 漢中 723001)

大鯢(Andriasdavidianus)為中國特有珍稀物種，是現存個體最大的兩棲動物，也是中國《人工繁育國家重點保護水生野生動物名錄》(第一批)物種之一[1]，具有較高的食用價值和藥用價值[2]。目前，有關大鯢營養組成[3]、活性肽[4]、膠原蛋白/明膠[5]、魚油[6]、胴體分割加工與貯藏保鮮[7]等方面的研究較多。一些大鯢養殖龍頭企業也推出了大鯢膠原蛋白、日化用品、速凍肉丸等深加工產品[8]，一定程度上促進了大鯢產業鏈的延伸。

肝臟是大鯢內臟的主要組成部分，約占內臟的50%～60%，是大鯢加工的主要副產物。動物肝臟含有豐富的營養物質[9]。目前對大鯢肝臟的研究主要涉及到營養組分及比例[10]、蛋白質種類[11]、脂肪酸種類及比例[12]等。飼養大鯢以魚餌料為主，商品鯢不同分割部位特別是肝臟有較重腥味，限制了部分消費者的接受度和進一步應用開發。水產品中腥味物質種類多樣[13]，其主要檢測方法為感官分析和儀器檢測[14]。揮發性風味物質的檢測技術如氣相色譜—嗅聞、電子鼻、氣相色譜—質譜聯用、全二維氣相色譜—飛行時間質譜和氣相—離子遷移譜等被廣泛運用[15-19]。與傳統氣相色譜—質譜聯用技術相比，氣相—離子遷移色譜(GC-IMS)是新興的揮發性有機物分離和檢測技術，具有樣品制備簡單、高靈敏度和風味成分可視化等優點，被逐漸用于水產品加工貯藏、烹飪過程中揮發性成分檢測[20-21]。

目前，脫腥方法主要是基于物理法、生物法、復合法等[22]，其中感官掩蔽法的使用最為廣泛。感官掩蔽法[23]主要通過浸泡、腌制等工藝，利用特殊風味掩蓋腥味物質，具有低成本、易操作等優點。茶葉是一種優良的脫腥原料，具有降低腥味、提高茶葉清香的能力。采用綠茶水作為脫腥劑對金槍魚進行脫腥處理，不僅可以降低金槍魚腥味，還不會引起魚肉污染[24]。張淼等[25]通過響應面法優化綠茶復合脫腥劑對銀鱈魚的脫腥效果。張朝敏等[26]發現茶多酚—海藻糖不僅能夠對銀鱈魚的腥味進行脫除，還能有效抑制細菌生長。此外，用紅茶對美國大口胭脂魚[27]進行處理，也取得了一定的脫腥效果。

課題組[8]前期研究利用GC-IMS對大鯢不同部位揮發性氣味成分進行了分析，發現大鯢肝臟與其他部位揮發性成分具有較大差異。但是有關大鯢肝臟脫腥前后揮發性氣味成分的研究尚未見報道。研究擬利用GC-IMS技術分析茶葉水提液處理對大鯢肝臟揮發性有機物的動態變化，并結合主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)等多元統計方法篩選潛在特征揮發性化合物，旨在為大鯢肝臟脫腥及開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

大鯢肝臟：漢中市龍頭山水產養殖開發有限公司，試驗當天大鯢分割生產線取樣，2 h內低溫運回實驗室后4 ℃冷藏備用；

漢中綠茶：市售；

蘆丁、沒食子酸：優級純，上海源葉生物科技有限公司；

兒茶素：色譜純，上海源葉生物科技有限公司；

福林酚、碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

乙酸：色譜純，國藥集團化學試劑有限公司；

乙腈：色譜純，美國默克公司。

1.1.2 主要儀器設備

風味分析儀：FlavourSpec?型，德國GAS公司；

高速低溫離心機：BR4I型，賽默飛世爾科技有限公司；

紫外可見分光光度計：8453型，安捷倫科技有限公司；

分析天平：FA3204B型，上海精科天美科學儀器有限公司；

液相色譜儀：1260型，安捷倫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品預處理

(1)茶葉水提液的制備：將綠茶粉碎，過40目，按茶水比(m綠茶∶V水)1∶200 (g/mL)加入100 ℃蒸餾水，浸泡2 h(每30 min搖動一次)，冷卻至(25±2)℃，取上清液，3 000 r/min離心10 min，收集上清液備用(含茶多酚1.25 g/100 mL，兒茶素74.05 mg/L，總黃酮0.06 g/100 mL)。

(2)大鯢肝樣品制備：大鯢肝臟經流水清洗后，切為薄片(厚度約0.7 cm)，準確稱取5 g大鯢肝臟薄片，加入25 mL茶葉水提液，分別浸泡0，5，10，15，20 min，流水清洗，用廚房紙吸干表面水分，分別標記為TE-0 min、TE-5 min、TE-10 min、TE-15 min和TE-20 min，裝入自封袋4 ℃冷藏備用。

1.2.2 感官評價 按GB/T 16291.2—2010執行，并參照王妍等[28]的方法制定如表1所示的評分標準。

表1 大鯢肝臟脫腥評價標準Table 1 Evaluation standard of giant salamander liver smell

1.2.3 大鯢肝揮發性成分分析 采用GC-IMS對脫腥處理后的大鯢肝臟揮發性氣味進行分析。精密稱取不同處理時間的大鯢肝臟勻漿2.0 g，置于20 mL頂空瓶中進行自動頂空進樣。進樣體積500 μL，孵育時間15 min，孵育溫度60 ℃，進樣針溫度85 ℃，孵化轉速500 r/min。GC-IMS參數：MXT-5色譜柱，15 mL，0.53 mm ID，1 μm FT，柱溫60 ℃，載氣/漂移氣為N2，IMS溫度45 ℃，分析時間20 min。

1.3 數據統計分析

結果以平均值±標準差表示，采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，t檢驗進行差異顯著性分析(P<0.05)。利用風味儀LAV和 Reporter、Dynamic插件分析風味物質數據。SIMCA-P 14.1軟件進行PCA、OPLS-DA分析，繪制散點圖、置換檢驗擬合曲線和VIP值圖。

2 結果與分析

2.1 不同脫腥時間下大鯢肝腥味值評分

由表2可知，大鯢肝初始腥味值為4.43，經茶葉水提液處理5 min后，腥味值顯著降低(P<0.05)；處理10 min后，隨著脫腥時間的增加，腥味降低幅度逐漸平緩，與項怡等[29]的結論相似。這可能是茶葉水提液中茶多酚類、黃酮類物質與大鯢肝揮發性成分發生相互作用，經脫腥處理后的大鯢肝帶有淡淡的茶香味[24]。

表2 不同脫腥時間下大鯢肝腥味值評分?Table 2 Smell score of giant salamander liver at different deodorization time

2.2 脫腥時間對大鯢肝臟揮發性成分的影響

由圖1可知，不同脫腥時間處理的大鯢肝中揮發性有機物在組間差異性觀察方面存在一定難度，故將三維譜圖進行降維處理以更好地分析脫腥時間對大鯢肝風味物質的影響。

離子峰兩側的每個點代表1種揮發性成分，顏色的深淺表示含量的高低圖1 不同脫腥時間下大鯢肝臟GC-IMS三維譜圖Figure 1 Three dimentional GC-IMS spectrum of the liver of giant salamander at different deodorization times

圖2(a)為圖1的二維俯視圖，圖2(b)為差異譜圖，為了使樣品間的差異性可視化，將未脫腥大鯢肝的譜圖作參照，其余4組樣品依次扣背景色至灰色。當樣品中的揮發性物質含量高于參比含量時，該物質顯示白色，反之顯示黑色。經歸一化處理后的反應離子峰位于橫坐標1.0處，1.0豎線兩側任意一點的顏色深淺可以反映出揮發性物質濃度的高低。

圖2 不同脫腥時間下大鯢肝臟GC-IMS二維譜圖Figure 2 Two dimentional GC-IMS spectrum of the liver of the salamander at different deodorization times

2.3 不同脫腥時間下大鯢肝臟GC-IMS揮發性成分定性分析

由表3可知，不同脫腥時間下大鯢肝樣品中共鑒定出32種揮發性有機物成分，包括10種醇類、8種醛類、5種酯類、5種酮類、3種烯烴類和1種醚類化合物。

由圖3可知，未經脫腥處理的大鯢肝臟中揮發性成分主要以醇類(29.80%)和酮類(44.00%)化合物為主，醛類(8.66%)、酯類(7.05%)、醚類(9.51%)和烯烴類(0.99%)化合物含量較少。經茶葉水提液處理后的揮發性成分組成發生了變化，脫腥20 min后的大鯢肝臟中揮發性成分仍以醇類(25.57%)和酮類(48.73%)為主，其次為醛類(12.36%)、酯類(4.80%)、醚類(7.79%)和烯烴類(0.75%)。5 min后，隨著脫腥時間的增長，肝臟中的揮發性成分并未大幅度波動。

圖3 不同脫腥時間下大鯢肝臟揮發性成分相對含量變化Figure 3 Relative content changes of volatile components in liver of giant salamander at different deodorization time

醇類化合物的相對含量在脫腥處理15 min時達到最小值23.4%，處理20 min時相對含量向上波動達到25.57%，但與0 min相比總體呈下降趨勢，與徐永霞等[30]的結果一致。其中異戊醇、異丁醇、異丙醇的相對含量較高，但其閾值較高，對腥味的貢獻較小。蘑菇醇具有蘑菇味、土腥味，閾值較低，是大鯢肝臟主要的腥味成分之一[8]，其相對含量較高，隨著脫腥時間的增加，含量與0 min 相比明顯降低。庚醇閾值和相對含量較低，在整個脫腥過程中波動較小。與庚醇變化趨勢相似，糠醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-2-丁醇在整個脫腥過程中相對含量波動較小，且相對含量較低。正己醇的閾值較高，相對含量較低，經脫腥處理其相對含量與未脫腥的相比明顯降低，但各脫腥時間下的相對含量無明顯差異。由表3可知，所有醇類化合物經脫腥處理后，其相對含量均有降低的趨勢，表明茶葉水浸泡有一定的脫腥效果。其脫腥機理可能是低級醇能溶于茶葉水，且茶葉水中化學成分復雜，部分組分與部分醇類反應使腥味減輕。

表3 不同脫腥時間下大鯢肝臟揮發性成分相對含量及定性分析?Table 3 Relative content and qualitative analysis results of volatile components in liver of giant salamander at different deodorization time

醛類化合物的相對含量呈先降低后增加的趨勢，脫腥處理15 min時的相對含量超過未脫腥的，脫腥處理5 min時的相對含量達到最小值7.69%。其中異戊醛、正己醛的相對含量較高且閾值較低[31]，對大鯢肉的腥味貢獻較大。異戊醛、正己醛、2-甲基丁醛在整個脫腥過程中的相對含量呈波動的趨勢，并分別在脫腥處理10，15，20 min 時的相對含量超過未脫腥的，而(E)-2-庚烯醛、反-2-辛烯醛、2-甲基丁醛的相對含量較未脫腥的呈降低的趨勢。除芳醛以外，低級醛的羰基可以與水中的氫形成氫鍵可溶于水，故部分醛類化合物的相對含量降低，而一些醛類的增加，可能是減少的醇類化合物部分氧化形成醛類，也可能是茶葉水攜帶至大鯢肝臟所致，其變化機理尚不明確。

酮類化合物的相對含量為44.00%～53.18%，其相對含量在整個脫腥過程中占有絕對優勢，且均明顯高于未脫腥的。2,3-丁二酮的閾值較低，但其相對含量較低，在整個脫腥過程中波動幅度較小。2-丁酮、2-戊酮的相對含量較高，但其閾值較高，對大鯢肉的腥味貢獻較小。脫腥后2-丁酮的相對含量較脫腥前降低，2-戊酮的相對含量呈波動趨勢，但變化幅度不大。丙酮的相對含量最高，在酮類化合物中占有絕對優勢，在脫腥處理15 min時達最大值42.44%，脫腥處理20 min時降至36.48%，經脫腥處理后丙酮的相對含量均高于未脫腥的，且處理前15 min，均隨脫腥時間的增加而增加，說明丙酮的相對含量主要來自于茶葉水[32]，而在脫腥處理20 min時出現小幅度的降低可能是大鯢肝臟吸收飽和且茶葉水中丙酮含量有限。

酯類化合物在整個脫腥過程中呈降低的趨勢，與吳燕燕等[33]的結果相似。丙酸乙酯的相對含量較低，在整個脫腥過程中波動較小，其余酯類化合物的相對含量均隨脫腥時間的延長而降低，說明茶葉水對大鯢肝臟酯類揮發性物質的脫除具有一定的作用，其相對含量的降低可能與醇類物質的減少有關。

烯烴類化合物在脫腥處理5 min時出現明顯的增加，其他時間的相對含量波動不大，其波動主要表現在雙戊烯的明顯波動。烯烴類化合物在脫腥處理0 min時相對含量較低，表明大鯢肝臟本身含該類化合物的含量降低，脫腥處理5 min時含量明顯增加，表明該物質為茶葉水攜帶至大鯢肝臟，而經脫腥處理10，15，20 min的相對含量較5 min 的明顯降低，且與0 min的相比波動不大，主要是因為雙戊烯在環境中極不穩定，容易發生反應失去雙鍵。

二甲基二硫醚閾值較低，脫腥處理5 min時由9.51%增加到10.02%，但增加不明顯，而后降低，在脫腥處理20 min 時降至7.79%。二甲基二硫醚有臭味[34]，不溶于水，易與氧化劑反應，其相對含量的減少主要是由于茶葉水中茶多酚、維生素C等氧化劑與其發生化學反應所致。

綜上，茶葉水對大鯢肝臟的最佳脫腥時間為10 min，脫腥機理主要涉及兩方面：① 部分腥味化合物可溶于茶葉水；② 一些腥味化合物與茶葉中的化合物發生反應。

2.4 不同脫腥時間下大鯢肝揮發性物質主成分分析

由圖4可知，在95%的置信區間內，前兩個主成分PC1和PC2的貢獻率分別為62.8%，19.2%，累計貢獻率為82%，說明這兩個主成分可以解釋82%的原始數據。累積Q2為0.645，表示模型解釋度高，預測能力較好。脫腥處理0，5 min的樣品位于PC1的負方向，脫腥處理10，15，20 min的樣品位于PC1正方向，說明在脫腥過程中大鯢肝揮發性氣味化合物發生了較大變化。脫腥處理0 min 的樣品位于第2象限，脫腥處理5 min的樣品位于第3象限，脫腥處理10 min的樣品位于第4象限，脫腥處理15 min的樣品分布于第1象限和第4象限，脫腥處理20 min的樣品位于第1象限，組間能夠實現較好的區分，但組內聚集程度低，差異較大。

圖4 不同脫腥時間下大鯢肝揮發性成分主成分Figure 4 PCA score plot of volatile organic compounds of giant salamander liver at different deodorization time

2.5 正交偏最小二乘判別及模型驗證

由圖5(a)可知，與無監督的PCA得分散點圖相比，不同脫腥時間下大鯢肝樣品得到較大程度的分離，聚類良好，降低了樣品之間的組內差異[35]。其中R2X為0.976，R2Y為0.964，Q2為0.806，說明OPLS-DA模型的解釋率和擬合度較高。由圖5(b)可知，截距值R2=0.641，Q2=-1.1，均小于OPLS-DA模型中的R2Y和Q2的原始值，回歸線呈向上的趨勢，模型未出現過擬合現象。

圖5 不同脫腥時間下大鯢肝揮發性成分OPLS-DA得分圖和置換檢驗Figure 5 OPLS-DA score and permutation of liver volatile components in giant salamander at different time of deodorization

2.6 潛在揮發性化合物的篩選

由圖6可知，S-plot圖兩端的變量對分型貢獻較大，對分型貢獻較小的變量聚集原點附近。各個組別之間Q2和R2均大于0.8，表明各組別間能很好區分。對不同組別分型貢獻較大的化合物有丙酮、2-丁酮單體、2-丁酮二聚體、蘑菇醇、2-戊酮、二甲基二硫醚、雙戊烯二聚體等。

圖6 組間S-plotFigure 6 S-plot between groups

以VIP>1為指標進行篩選[36]，大鯢肝脫腥過程中共篩選出10種潛在特征揮發性化合物[圖7(a)]，包括4種酮類(丙酮、2-丁酮單體、2-丁酮二聚體和2-戊酮)、2種醇類(蘑菇醇和異戊醇單體)、2種醛類(異戊醛單體和正己醛單體)、1種烯類(雙戊烯二聚體)和1種醚類(二甲基二硫醚)。由圖7(b)可知，脫腥過程中，隨著脫腥時間的延長，蘑菇醇、2-丁酮二聚體、異戊醇單體、2-丁酮單體含量總體呈下降趨勢；正己醛單體、異戊醛單體、丙酮相對含量呈上升趨勢；雙戊烯二聚體、2-戊酮、二甲基二硫醚相對含量在脫腥處理5 min時最高。

圖7 大鯢肝脫腥過程中揮發性成分Figure 7 Volatile components in giant salamander sliver during deodorization

3 結論

利用茶葉水提液對大鯢肝進行脫腥處理，采用感官評價結合GC-IMS技術對大鯢肝腥味進行分析，初步確定了利用茶葉水提液脫腥處理前后大鯢肝揮發性有機物成分的變化。結果表明，隨著脫腥時間的增加，腥味值逐漸降低。利用GC-IMS技術共鑒定出32種揮發性有機化合物，包括10種醇類、8種醛類、5種酯類、5種酮類、3種烯烴類和1種醚類。主成分分析表明，兩個主成分累積貢獻率達到82%，組間聚類較好，組內差異較大。采用正交偏最小二乘法判別分析建立了穩定性和預測能力較好的判別模型，依據VIP>1篩選出10種揮發性化合物，包括4種酮類(丙酮、2-丁酮單體、2-丁酮二聚體和2-戊酮)、2種醇類(蘑菇醇和異戊醇單體)、2種醛類(異戊醛單體和正己醛單體)、1種烯類(雙戊烯二聚體)和1種醚類(二甲基二硫醚)。脫腥過程中，隨著脫腥時間的延長，蘑菇醇、2-丁酮二聚體、異戊醇單體、2-丁酮單體含量總體呈下降趨勢，正己醛單體、異戊醛單體、丙酮相對含量呈上升趨勢。后續仍需對大鯢肝不同脫腥時間下的潛在揮發性化合物標記進行驗證。