不同產地裸燕麥代謝產物差異分析

代安娜 張麗媛 閔廣柳 于潤眾

(1. 黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2. 黑龍江八一農墾大學信息與電氣工程學院，黑龍江 大慶 163319)

燕麥(AvenasativaL.)是禾本科燕麥屬作物，主要分為帶稃型和裸粒型，具有營養價值、飼用價值和藥用價值[1-2]。目前有關燕麥發酵品質、代謝產物，以及功能性成分對腸道菌群和糖脂代謝的影響等已有相關研究，肖燕子等[3]利用高效液相色譜法測定呼倫貝爾不同品種燕麥的發酵品質(丁酸、丙酸、乙酸和乳酸含量)，但未對糖類、氨基酸等代謝物進行檢測；Boczkowska等[4]利用傅里葉紅外光譜對波蘭不同產地燕麥樣品的代謝指紋圖譜進行了分析，但未對代謝物的含量及差異代謝物進行分析；Loskutov等[5]使用氣液相色譜—質譜研究了野生和栽培燕麥的化合物組成和總相對含量，發現栽培品種中化合物的含量波動幅度比野生品種小(在某些情況下顯著)，但未利用代謝組學技術分析差異化合物；王如月等[6]利用燕麥β-葡聚糖和β-葡寡糖發酵人來源糞便，利用氣相色譜儀分析發現發酵液中乙酸和丙酸含量增加；付媛等[7]研究裸燕麥球蛋白源多肽對衰老小鼠體內的抗氧化作用機制，利用超高效液相色譜質譜聯用法對小鼠腦組織進行代謝組學分析；李英浩等[8]研究了干旱脅迫下腐植酸對燕麥葉片非結構性碳水化合物(NSC)代謝的影響，發現腐植酸可以通過調控燕麥葉片NSC的代謝來響應干旱脅迫。不同的代謝產物對機體代謝途徑的影響也不是單一的，與傳統的化學分離模式相比，代謝組學技術可以對代謝物進行定量分析，尤其是發現種間或種內的代謝物相對含量的差異，以及進一步通過非靶向代謝組學技術對代謝機制進行分析，應用在食品的產地溯源，摻假鑒別和安全風險檢測等方面[9-12]。課題組[13-14]前期也對不同品種的綠豆代謝產物進行了分離鑒定，以及對來自3個產地同一品種的大豆進行了差異代謝產物及差異代謝機制分析。

研究擬將GC-MS聯合代謝組學技術應用到兩個不同產地裸燕麥的代謝產物分析中，對比分析樣品間的差異代謝產物，并對差異代謝產物的代謝機制進行探索，以期為選擇符合營養或品質要求的燕麥品種提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

河北張家口裸燕麥(HZ)和黑龍江齊齊哈爾裸燕麥(HQ)：市售；

2-氯-L-苯丙氨酸：上海麥克林生化科技有限公司；

吡啶(≥99.9%)：色譜級，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

N，O-雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)：上海麥克林生化科技有限公司；

甲醇：色譜級，美國Fisher技術公司。

1.1.2 主要儀器設備

氣相色譜質譜聯用儀(三重四級桿)：TQ8040型，配備EI離子源及AOC-5000型自動進樣，日本島津技術有限公司；

色譜柱：Rxi-5Sil型，日本島津技術有限公司；

離心機：CR3i multifunction型，美國Fisher技術公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DGG-9140A型，上海森信實驗儀器有限公司；

氮吹儀：MTN-2800D型，天津奧特塞恩斯儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本前處理 樣品經粉碎研磨均勻后，過100目篩，按四分法進一步取樣，分別稱取50 mg粉末于2 mL的EP管中，加入800 μL甲醇和10 μL內標(2-氯苯丙氨酸)，快速混勻1 min后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取200 μL上清液，轉入進樣小瓶中用氮吹儀吹干，備用[13]。

1.2.2 衍生化處理 取30 μL甲氧銨鹽酸吡啶溶液加入到濃縮后的樣品中(即吹干后的小瓶)，快速混勻至完全溶解，37 ℃恒溫箱放置1.5 h后取出，加入30 μL三氟乙酰胺(BSTFA)，70 ℃烘箱中放置1 h。

1.2.3 GC-MS分析

(1)GC參數：柱溫80 ℃，進樣口溫度240 ℃，分流進樣，恒定線速度控制流量，載氣為氦氣，柱流量1.20 mL/min，線速度40.4 cm/s，分流率15，程序升溫：0～2 min，80 ℃；10 ℃/min 升到320 ℃，保持6 min，運行32 min。

(2)MS參數：離子源溫度230 ℃，接口溫度300 ℃，溶劑切割時間2 min，采集模式Q3 Scan，掃描范圍為45～550 (m/z)。

1.3 數據處理

采用Excel軟件對GC-MS數據進行統計分析，并將獲得的燕麥代謝物數據與NIST 14數據庫進行比較以獲得結構信息并分類，研究燕麥樣品的差異代謝產物。

2 結果與討論

2.1 代謝產物的分離與鑒定

由圖1和圖2可知，樣品中各組分分離良好，基線穩定。兩個不同地區裸燕麥的總離子流圖大致相似，但是在25.0～27.0 min時間段存在不同。

1.氨基戊酸 2.異丁酸 3.L-纈氨酸 4.DL-乳酸 5.L-丙氨酸 6.甘氨酸 7.甘油 8.異亮氨酸 9.L-脯氨酸 10.琥珀酸 11.富馬酸 12.L-絲氨酸 13.L-蘇氨酸 14.蘋果酸 15.L-蘇糖醇 16.3-氨基-2-哌啶酮 17.L-天冬氨酸 18.順-4-氨基環己烷羧酸 19.左旋-谷氨酸 20.木糖醇 21.磷酸 22.丙酸 23.左旋-谷酰胺 24.β-D-呋喃果糖 25.肉豆蔻酸 26.D-葡萄糖 27.肌醇 28.D-葡萄糖酸 29.棕櫚酸 30.亞油酸 31.油酸 32.反油酸 33.硬脂酸 34.花生酸 35.蔗糖 36.甘露二糖 37.纖維二糖 38.2-亞油酰甘油圖1 HZ裸燕麥總離子圖譜Figure 1 Total ion atlas of HZ naked oats

1.氨基戊酸 2.L-纈氨酸 3.DL-乳酸 4.L-丙氨酸 5.甘油 6.L-脯氨酸 7.琥珀酸 8.富馬酸 9.L-絲氨酸 10.L-蘇氨酸 11.蘋果酸 12.L-蘇糖醇 13.3-氨基-2-哌啶酮 14.L-天冬氨酸 15.順-4-氨基環己烷羧酸 16.左旋-谷氨酸 17.羊毛硫氨酸 18.木糖醇 19.十八烯酸單甘油酯 20.磷酸 21.丙酸 22.左旋-谷酰胺 23.萘普生 24.β-D-呋喃果糖 25.D-呋喃果糖 26.D-松醇 27.半乳糖酸 28.吡喃半乳糖 29.L-塔羅糖 30.D-葡萄糖醇 31.β-D-呋喃半乳糖 32.棕櫚酸 33.亞油酸 34.反油酸 35.油酸 36.硬脂酸 37.9-十六碳烯酸 38.D-葡萄糖醛酸 39.17-十八炔酸 40.13烯烏蘇酸 41.蔗糖 42.1-單棕櫚酸甘油 43.單硬脂酸甘油酯 44.β-乳糖 45.谷甾醇圖2 HQ裸燕麥總離子圖譜Figure 2 Total ion atlas of HQ naked oats

通過與NIST標準譜庫進行對比分析，兩個產地裸燕麥共檢測出了56種代謝產物(HZ有38種，HQ有45種)，分為有機酸、脂肪酸、糖及其衍生物、氨基酸和中間產物。有機酸包括D-葡萄糖酸、蘋果酸、氨基戊酸、異丁酸、丙酸、富馬酸、琥珀酸、DL-乳酸；脂肪酸有棕櫚酸、油酸、反油酸、亞油酸、硬脂酸、9-十六碳烯酸、17-十八炔酸、13-烯烏蘇酸、花生酸、肉豆蔻酸；糖及其衍生物有木糖醇、β-D-呋喃果糖、D-呋喃果糖、D-葡萄糖、吡喃半乳糖、L-塔羅糖、D-葡萄糖醇、β-D-呋喃半乳糖、蔗糖、甘露二糖、纖維二糖、β-乳糖、L-蘇糖醇、谷甾醇；氨基酸有L-纈氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-異亮氨酸、L-丙氨酸、L-蘇氨酸、左旋-谷氨酸、L-天冬氨酸；中間產物包括磷酸、甘油、3-氨基-2-哌啶酮、順-4-氨基環己烷羧酸、羊毛硫氨酸、十八烯酸單甘油酯、左旋-谷酰胺、萘普生、D-松醇、肌醇、1-單棕櫚酸甘油、D-葡萄糖醛酸、單硬脂酸甘油酯、半乳糖酸和2-亞油酰甘油。

2.2 相同代謝產物分析

由表1可知，兩個地區的裸燕麥共有27個相同代謝產物，其中相對含量最高的是亞油酸，均在10%以上，其次是油酸(HZ 7.21%，HQ 0.49%)、反油酸(HZ 0.29%，HQ 7.11%)、氨基戊酸(HZ 5.91%，HQ 4.64%)、丙酸(HZ 4.97%，HQ 5.27%)、棕櫚酸(HZ 4.97%，HQ 4.54%)、甘油(HZ 7.45%，HQ 3.63%)、蔗糖(HZ 2.63%，HQ 18.62%)、硬脂酸(HZ 1.32%，HQ 0.99%)，而其他相同化合物的相對含量均在1%以下。

表1 兩樣品相同代謝產物的相對含量Table 1 The same metabolites relative content

燕麥本身具有耐寒性，所以脂肪酸的含量會偏高，種類也相對較多。而其他相對含量較低的代謝產物均為中間代謝產物，主要為氨基酸和有機酸，說明燕麥中三羧酸循環較強，三羧酸循環又與糖類代謝、脂肪酸代謝、能量代謝相關，所以其相關代謝途徑也會加強，從而產生對人體有益的作用[15-17]。人體中氨基酸的代謝主要包括兩個方面：① 用于合成機體自身所特有的蛋白質、多肽及其他含氮物質；② 通過脫氨作用、轉氨作用、聯合脫氨或脫羧作用，分解成了α-酮酸、胺類及二氧化碳。由氨基酸分解生成的α-酮酸被轉化為糖和脂類，或者再合成某些非必需氨基酸，也可以通過三羧酸循環被氧化成二氧化碳和水，以釋放能量。有機酸參與合成酚類、氨基酸、酯類和芳香物質，以及光合作用和呼吸作用[18]。而HZ和HQ代謝產物含量不同可能是因為環境、產地及自身性質，亞油酸在HZ和HQ中含量均較高，可能是因為自身不飽和脂肪酸含量高，并且其主要脂肪酸就是亞油酸，所以含量高；而反油酸、蔗糖、甘油在HQ中含量高，在HZ中含量卻很少，可能是因為燕麥是喜冷涼作物，齊齊哈爾晝夜溫差大，雨量大，輻射充足，雨熱同季，四季特點十分明顯，另外齊齊哈爾土壤資源豐富，土地肥沃，而河北雨季、干季相當分明，并且正值雨季時，太陽輻射量會相應減少，所以在HQ中儲能含量高。

2.3 差異代謝產物及代謝機制分析

2.3.1 HZ樣品 HZ有11種差異代謝產物，包括2種有機酸，2種氨基酸，2種脂肪酸，3種糖類及2種中間產物，其相對含量如表2所示，2-亞油酰甘油(6.960%)相對含量最高，另外D-葡萄糖酸(1.160%)也有較高的相對含量，而其他物質均在1%以下。其中葡萄糖、甘露二糖、纖維二糖、肌醇和D-葡萄糖酸參與糖代謝，甘氨酸和L-異亮氨酸參與氨基酸代謝，肉豆蔻酸和花生酸參與脂肪酸代謝。異丁酸代謝途徑未知，可能為中間代謝產物，可能是氨基酸代謝途徑的中間產物，同時氨基酸代謝途徑占比最大。酸為單不飽和脂肪酸，其結構不夠緊密，熔點低，推測2-亞油酰甘油是油酸的代謝中間產物。河北雨季、干季分明，生長季節氣候爽涼，故肉豆蔻酸、花生酸等儲能代謝產物較多，另外河北屬半干旱地區，年降水量為330～400 mm，水資源不足，所以進行光合作用次數較多，轉化成的糖類也較多，故糖類及其衍生物較多，張家口土壤種類豐富，富含有機質和礦物質，故有機酸和氨基酸含量高，D-葡萄糖酸和異丁酸為一種有機酸，可促進三羧酸循環，加強代謝途徑，甘氨酸和L-異亮氨酸可合成蛋白質。D-葡萄糖酸通過葡萄糖和UTP反應形成尿苷二磷酸葡糖(UDPG)，然后被氧化成UDP-葡糖醛酸，甘氨酸由乙醛酸與谷氨酸發生轉氨反應生成，L-異亮氨酸是由L-天冬氨酸在天冬氨酸激酶作用下合成L-蘇氨酸，L-蘇氨酸在L-蘇氨酸脫水酶作用下發生脫水反應，并進一步產生L-異亮氨酸，同時L-蘇氨酸的含量受L-異亮氨酸反饋抑制[19]。

表2 HZ差異代謝產物相對含量Table 2 Relative content of HZ differential metabolites

2.3.2 HQ樣品 HQ有18種差異代謝產物，包括3種脂肪酸，7種糖類及8種中間產物，其相對含量如表3所示，谷甾醇含量最高(1.420%)，其次是D-呋喃果糖和1-單棕櫚酸甘油(0.700%)，其他物質含量均在0.6%以下。D-呋喃果糖、吡喃半乳糖、L-塔羅糖、β-D-呋喃半乳糖、β-乳糖、D-葡萄糖醇和谷甾醇參與糖代謝，十八烯酸單甘油酯、9-十六碳烯酸、17-十八炔酸、13-烯烏蘇酸、1-單棕櫚酸甘油和單硬脂酸甘油酯參與脂肪酸代謝。D-松醇參與膽固醇酯代謝循環，由乙酰輔酶A經一系列合成轉變而成，半乳糖酸參與丙酮酸代謝途徑，D-葡萄糖醛酸參與葡糖醛酸途徑，同時脂肪酸代謝途徑占比更大。脂肪酸可為燕麥提供能量，對植物本身的抗逆性起重要的作用，使其可適應寒冷的生長環境，也可在燕麥的生長過程中增強其抗旱屬性。齊齊哈爾溫度較低，晝夜溫差大，雨熱同季，輻射充足，因此燕麥代謝產物中糖類種類較多，經過光合作用或其他糖之間的相互轉化及衍生形成，另外其中間產物可加強代謝，使代謝產物增多。

表3 HQ差異代謝產物相對含量Table 3 Relative content of HQ differential metabolites

HQ中檢測出了羊毛硫氨酸與萘普生。羊毛硫氨酸是含硫氨基酸的一種，其結構和胱氨酸相似，它的存在也高度依賴于胱氨酸的含量。胱氨酸斷開弱二硫鍵產生脫氫丙氨酸，后者同胱氨酸結合生成羊毛硫氨酸，脫氫丙氨酸可由絲氨酸生成，該燕麥中存在絲氨酸，故在HQ中檢測出了羊毛硫氨酸。萘普生(Naproxen，NPX)化學名稱為α-甲基-6-甲氧基-2-萘乙酸，是一種非甾體類抗炎藥物，研究[20-22]表明地表水、地下水及飲用水中均已檢測到萘普生，這對生態環境的安全構成了嚴重威脅。而HQ中檢測出萘普生，可能是因為燕麥在生長過程中受到污染水的灌溉進而檢測出萘普生。

HZ和HQ分別有5種和7種差異代謝物參與糖代謝，而HZ有2種差異代謝物參與氨基酸代謝途徑，HQ有1種差異代謝物參與氨基酸代謝。HZ有3種差異代謝物參與脂肪酸代謝，HQ有6種參與該途徑，此外HQ有1種差異代謝物參與膽固醇酯代謝、1種參與丙酮酸代謝、1種參與葡糖醛酸代謝。由此可以得出HQ的代謝分支途徑要較HZ的多。燕麥代謝產物的不同也可能是因為外界環境的影響因素，如對環境影響的感受性、耐受性以及對環境的應激性代謝等。兩種不同來源的燕麥中的代謝產物有所不同，說明產地對燕麥代謝產物具有顯著影響，因此差異代謝產物可以用作產地間區分的依據。

3 結論

采用衍生的GC-MS技術對不同地區(河北張家口、黑龍江齊齊哈爾)裸燕麥中的代謝產物進行了分析。試驗結果表明，在兩個產地同一品種的裸燕麥中共檢測出56種代謝產物，河北張家口裸燕麥的代謝產物占38種，其中有11種差異代謝產物，黑龍江齊齊哈爾裸燕麥的代謝產物占45種，其中有18種差異代謝產物。不同產地對燕麥代謝產物具有顯著影響，可以利用差異代謝產物用作產地間區分的依據。試驗只分析鑒定了來自兩個產地同一品種燕麥的代謝產物和差異代謝產物及代謝機制，后續可以進一步利用代謝組學技術，對同一產地不同品種的燕麥，或多個產地不同品種的燕麥或其他未進行試驗的糧食作物等進行代謝組學分析。