不同產地竹節參中7種皂苷含量測定及化學計量學評價

張思敏 張 也 伍紅年，3 劉隆基 申佩瑤 嚴建業 楊 磊

(1. 湖南中醫藥大學科技創新中心，湖南 長沙 410208；2. 湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；3. 瀏陽市人民醫院，湖南 長沙 410399；4. 中南林業科技大學生命科學與技術學院，湖南 長沙 410004)

竹節參(PanaxjaponicusC.A.Mey.)為五加科人參屬植物，以干燥根莖入藥，也具有較高的食用價值。云南獨龍族將竹節參與鮮肉、雞蛋一同煎煮作為藥膳，用于病后補虛及改善虛勞咳嗽等癥狀[1]；在土家族居住區，人們用其泡酒服用[2]。竹節參主要化學成分為皂苷、多糖、氨基酸以及揮發油[3-4]等。研究表明，竹節參皂苷具有抗潰瘍[5]、抗腫瘤[6]、抗腦缺血損傷[7]、保護心臟[8]、保肝[9]、降血脂[10-11]及抗炎鎮痛[12-14]等功效。其保健功效也被挖掘，如降血脂、降血糖[3]的藥理作用可用于預防“三高”；抗氧化[15]的藥理作用可用于延緩衰老；竹節參皂苷Ⅳa對脂肪細胞分化有明顯的抑制作用可用于減肥，有望成為減肥產品的功能性食品原料[16]。但由于對竹節參過度挖掘，導致其野生資源銳減。又因人工栽培技術不成熟，產品質量參差不齊，限制了竹節參的應用。為更好推進竹節參在臨床和生活中廣泛使用，加強對其指標性成分的質量控制至關重要。

《中國藥典》2020版采用HPLC法測定其中的人參皂苷Ro(竹節參皂苷Ⅴ)和竹節參皂苷Ⅳ來控制質量，而這兩個成分的定量不能較全面地控制竹節參藥材質量。目前研究植物中功能性成分定量分析的方法有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、超高效液相色譜法(UPLC)等[17-19]。由于UPLC法具有靈敏度、分辨率以及柱效好，分離效率高，消耗溶劑少等特點[20]，而且未見采用UPLC法同時測定竹節參中的7種皂苷類成分的相關報道。

研究擬建立測定竹節參中7種皂苷類成分含量的UPLC法，并采用聚類分析、主成分分析與質量波動分析等化學計量學手段進行綜合評價，以期為竹節參的質量綜合評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

9批竹節參樣品(詳細信息見表1)：經湖南中醫藥大學龔力民副教授鑒定為五加科人參屬植物竹節參PanaxjaponicasC.A.Mey的干燥根莖；

表1 樣品信息Table 1 Sample information

人參皂苷Rg1(批號wkq15121303)、人參皂苷Re(批號wkq16081605)、人參皂苷Rb1(批號wkq16060402)：質量分數≥98%，四川省維克奇生物科技有限公司；

竹節參皂苷Ⅴ(批號HG027158198)、竹節參皂苷Ⅳ(批號HA305950198)、竹節參皂苷Ⅳa(批號HC027157198)：質量分數≥98%，寶雞市辰光生物科技有限公司；

假人參皂苷RT1(批號170726)：質量分數≥98%，成都普菲生物技術有限公司；

乙腈、甲醇：色譜純，德國默克股份有限公司；

試驗用水均為超純水；

其他均為分析純。

1.1.2 主要儀器設備

超高效液相色譜儀：Waters ACQUITY UPLC型，美國Waters公司；

超純水儀：Option R7 utra AN型，英國ELGA LabWaters公司；

數控超聲波清洗器：KQ-5200DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

分析天平：ME204/02型，梅特勒—托利多國際貿易(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 混合對照品溶液的制備 參考文獻[21]。分別精密稱定人參皂苷Rg1、Re、Rb1、竹節參皂苷Ⅴ、Ⅳ、Ⅳa與假人參皂苷RT1各對照品適量，分別置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得到含人參皂苷Rg1(100 μg/mL)、Re(68 μg/mL)、Rb1(102 μg/mL)、竹節參皂苷Ⅴ(1 500 μg/mL)、Ⅳ(700 μg/mL)、Ⅳa(800 μg/mL)，假人參皂苷RT1(440 μg/mL)的混合對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 將不同來源竹節參藥材制成粉末狀，精密稱取過40目篩的各批次粉末1.0 g，置于錐形瓶中，加70%的甲醇50 mL，稱重，加熱回流提取1 h，冷卻至室溫，再次稱重，并用70%的甲醇補足失重，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液即得。

1.2.3 色譜條件 采用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色譜柱；流動相為水(A)—乙腈(B)，梯度洗脫，0.0～3.5 min，79.0% A；3.5～6.0 min，79.0%～74.0% A；6.0～6.5 min，74.0%～66.3% A，6.5～13.0 min，66.3%～65.0% A，13.0～14.0 min，65.0%～79.0% A；流速0.4 mL/min；檢測波長203 nm；柱溫30 ℃；進樣量1 μL。

1.2.4 方法學考察

(1)專屬性試驗：分別精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各1 μL，按1.2.3的條件進行測定。

(2)線性關系考察：參照文獻[21]。

(3)精密度、穩定性及重復性試驗：參照文獻[21]。

(4)加樣回收試驗：精密稱取已知含量供試品(S6)0.5 g，加入適量各對照品，精密稱定。

1.2.5 含量測定 分別取不同產地的竹節參樣品，按1.2.2的方法制備樣品溶液，按1.2.3的條件進樣檢測，計算各皂苷成分的含量。

1.2.6 化學計量學分析

(1)聚類分析：以S1～S9樣品中7個成分含量為變量，采用組間聯接，并選擇“平方Euclidean 距離”法進行聚類分析。

(2)主成分分析：對來自不同產地竹節參7種皂苷類成分的含量標準化處理后，對處理結果進行主成分(PCA)分析。

(3)質量波動分析：為探究竹節參樣品間的質量，參照文獻[22—23]引入參數P值，對各產地竹節參藥材質量進行評價，按式(1)計算質量波動值。

(1)

式中：

P——質量波動值；

Ci——給定化合物的含量，μg/mL；

1.2.7 數據分析 運用SPSS 22.0數理統計軟件，進行聚類分析和主成分分析；運用Origin 2019進行質量波動分析。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 專屬性試驗 由圖1可知，供試品溶液的色譜峰與混合對照品的呈現出相同保留時間，此外，在空白對照色譜圖中對應位置處無色譜峰，表明該方法專屬性良好。

2.1.2 線性關系的考察 將混合對照品溶液配制為系列質量濃度，按1.2.3的條件進樣分析，對7種皂苷類成分進行線性關系考察，結果見表2。由表2可知，竹節參各皂苷成分在相應的質量濃度范圍內線性關系良好。

表2 7種指標成分的回歸方程及線性范圍Table 2 Regression equation and linear range of seven index components

2.1.3 精密度試驗 取S6樣品，按1.2.2的方法制備供試品溶液，按1.2.3的條件重復進樣6次，測得竹節參各皂苷成分的色譜峰峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為0.20%，0.34%，1.34%，0.59%，0.49%，0.47%，1.20%，表明儀器的精密度結果良好。

2.1.4 穩定性試驗 取S6樣品，按1.2.2的方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12 h按1.2.3項下的色譜條件進樣測定，測得竹節參中各皂苷成分色譜峰峰面積的RSD依次為1.57%，1.23%，2.67%，1.26%，2.05%，2.05%，1.88%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.1.5 重復性試驗 取S6樣品，按1.2.2的方法平行制備6份供試品溶液，按1.2.3的條件進樣分析，測得竹節參中各皂苷成分色譜峰峰面積的RSD依次為0.23%，0.40%，2.85%，0.23%，0.31%，0.33%，0.27%，表明方法重復性良好。

2.1.6 加樣回收試驗 精密稱取S6樣品0.5 g，加入適量各對照品，精密稱定。按1.2.2的方法制備供試品溶液，進樣測定。由表3可知，各皂苷平均回收率均在95%～105%，相對標準偏差(RSD)均小于3%，表明該方法的回收率良好。

表3 7種指標成分的加樣回收試驗Table 3 Spike-and-recovery experience of seven index components (n=5) %

1.人參皂苷Rg1 2.人參皂苷Re 3.人參皂苷Rb1 4.竹節參皂苷Ⅴ 5.假人參皂苷RT1 6.竹節參皂苷Ⅳ 7.竹節參皂苷Ⅳa圖1 混合對照品溶液、竹節參樣品溶液及空白的HPLC色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference solution,sample solution of Panax japonicus and blank

2.2 樣品含量測定

經測定，各批次竹節參中各皂苷成分含量結果見表4。為充分展示各批次竹節參中7種成分含量的分布特征，以測得的含量結果作雷達圖，見圖2。由于各批次各成分含量相差很大，作圖時，對各成分含量進行修正，使各成分含量乘以修正系數，各系數定：竹節參皂苷Ⅴ為1，人參人參皂苷Rg1為15，人參皂苷Re為30，人參皂苷Rb1為15，人參皂苷RT1為10，竹節參皂苷Ⅳ為2，竹節參皂苷Ⅳa為3。由表4可知，竹節參皂苷V在各批次竹節參樣品中含量較高，其次是竹節參皂苷Ⅳ、Ⅳa；人參皂苷Rb1與假人參皂苷RT1在S6中含量較其他樣品高。由圖2可知，S6、S7與S8的整體輪廓圖相對較大，由于這3個批次中的假人參皂苷RT1含量相對較高，特別是S6的輪廓圖形與其他各批次的輪廓圖差異性較大，由于S6中的7個成分含量均較高；而其他批次的竹節參的整體輪廓圖相似，表明其他批次各成分含量更為均勻。

圖2 不同批次竹節參樣品7種皂苷含量的雷達圖Figure 2 Radar images of seven saponins in different batches of Panax japonicus samples

表4 不同批次竹節參樣品皂苷含量測定平均結果Table 4 Determination average results of different batches of Panax japonicus samples (n=3) mg/g

《中國藥典》2020版規定，竹節參皂苷Ⅴ(人參皂苷Ro)與竹節參皂苷Ⅳa含量≥1.5%。由含量測定結果可知，試驗9批不同產地竹節參樣品中，竹節參皂苷Ⅴ含量為42.91～97.16 mg/g，竹節參皂苷Ⅳa含量為15.76～32.66 mg/g，均明顯高于藥典標準，并且這兩個成分在9個批次樣品中的質量波動較小。但某些成分在不同產地間含量波動較大，說明產地是造成竹節參質量差異的原因之一。

2.3 化學計量學分析

2.3.1 聚類分析 對各批次樣品的含量測定結果進行聚類分析見圖3。由圖3可知，當距離介于15～20時主要聚為3類，其中，四川雅安(S7)、四川樂安(S8)以及湖北神農架(S3)為Ⅰ類；湖北恩施(S1)、湖南石門(S4)、江西吉安(S5)、貴州貴陽(S2)以及云南麗江(S9)為Ⅱ類；四川大涼山(S6)為Ⅲ類。

圖3 竹節參樣品聚類分析樹狀圖Figure 3 Cluster analysis tree of Panax japonicus samples

2.3.2 主成分分析 為進一步探討竹節參不同產地間的差異，采用主成分分析進行評價，結果見表5。由表5可得，前3個因子累計貢獻率為90.635。由圖4可知，前3個成分特征值下降較快，因此折線較為陡峭，其余成分特征值變化較為平緩。取特征值>1的成分作圖，結果見圖5。由圖5可知，9批樣品可分為3類，S6為Ⅰ類，S7、S8、S3為Ⅱ類，S1、S2、S4、S5、S9為Ⅲ類，與聚類分析結果一致。

圖4 不同產地竹節參主成分分析碎石圖Figure 4 Detritus diagram of principal component analysis of Panax japonicus from different habitats

圖5 不同產地竹節參主成分分析二維圖Figure 5 Two-dimensional principal component analysis of Panax japonicus in different regions

表5 主成分初始特征值和貢獻率Table 5 Initial eigenvalue and contribution rate of principal components

綜合聚類分析和主成分分析并觀察各成分含量可發現，四川大涼山樣品中人參皂苷Rg1與假人參皂苷RT1含量明顯高于其他批次，提示這可能是造成差異的原因之一。其次，竹節參大多生于高山灌叢陰濕地或巖石溝澗旁，地理位置與生長環境也是導致竹節參藥材批次間分類的原因。

2.3.3 質量波動分析 當參數P值越靠近1時，各批間樣品一致性越好。一般而言，當P值在0.75～1.25范圍內表明該成分的質量波動較小，P值過大或過小表明該成分質量波動較大，是竹節參樣品質量波動的重要體現。由圖6可知，人參皂苷Rg1、Rb1以及假人參皂苷RT1超出此范圍較多，特別是人參皂苷Rg1與假人參皂苷RT1波動范圍較大。結合表2、聚類分析及主成分分析可知，人參皂苷Rg1、Rb1與假人參皂苷RT1均在樣品S6中含量較高，含量波動較大，因此S6被單獨分為一類，與聚類分析及主成分分析結果相呼應。人參皂苷Re及竹節參皂苷Ⅴ、Ⅳ的P值基本在0.75～1.25，表明這幾個成分對竹節參的質量波動影響不大。

圖6 竹節參樣品7個成分的Box-chart圖Figure 6 Box-chart plot of seven components of Panax japonicus sample

3 結論

建立了采用UPLC同時測定竹節參藥材中7種皂苷類成分含量的方法，該法柱效高，出峰快，耗能少；并結合化學計量學中的聚類分析、主成分分析與質量波動分析對竹節參藥材質量的優劣進行了評價。研究結果表明，不同產地的竹節參藥材各皂苷類成分含量均有較大的差異。竹節參皂苷V、竹節參皂苷Ⅳ以及竹節參皂苷Ⅳa 3種皂苷在各批次竹節參藥材中含量較高，其中竹節參皂苷V>竹節參皂苷Ⅳ>竹節參皂苷Ⅳa；人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1與假人參皂苷RT1含量則較低，特別是竹節參皂苷V與竹節參皂苷Ⅳ均高于藥典標準。竹節參中含有豐富的化學成分，試驗僅對竹節參藥材中7種皂苷成分含量測定進行了研究，若要全面評價竹節參藥材質量還可以對竹節參中更多的成分及活性進行系統研究。