參附注射液對(duì)膿毒癥大鼠腸黏膜屏障的影響及機(jī)制研究*

朱滿剛 伍 萬(wàn)△ 楊 月 葉遠(yuǎn)玲 彭偉獻(xiàn)

（1.浙江省杭州市中醫(yī)院，浙江 杭州 310007；2.浙江省杭州市臨平區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，浙江 杭州 311100）

膿毒癥是嚴(yán)重感染引起的宿主反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙。由于高度復(fù)雜的宿主反應(yīng)，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，救治困難，其發(fā)病率、死亡率仍然較高，嚴(yán)重危及患者的生命。在膿毒癥發(fā)生、發(fā)展中往往并發(fā)胃腸道損害，引起腸道菌群易位，并發(fā)多起功能衰竭，是膿毒癥死亡的重要原因之一［1-2］。本研究通過盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)制備重度膿毒癥模型，觀察不同劑量參附注射液對(duì)血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）含量、回腸組織丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性及緊密連接蛋白o(hù)ccludin干預(yù)效果，進(jìn)一步探究參附注射液對(duì)膿毒癥大鼠腸黏膜屏障的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只8周清潔級(jí)SD大鼠，雄雌各20只，體質(zhì)量（200±35）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)條件合格證：SYXK（浙）2018-0012，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)合格證編號(hào)：2020366。

1.2 試藥與儀器 參附注射液（雅安三九藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z51020664）。試劑Bax抗體（貨號(hào)：ER1904-10）、Bcl-2抗體（貨號(hào)：ER0512）、Occludin Antibod（貨號(hào)：sc-271842，批號(hào)：A0314）（Abcam 公司提供），TNF-α（貨號(hào)：F16960）、IL-10（貨號(hào)：F15900）、MDA（貨號(hào)：F16194）、SOD（貨號(hào)：F16742）ELISA試劑盒（上海西唐生物有限公司提供），TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒（ROCHE，貨號(hào)：11684817910，南京凱基生物科技有限公司）。

1.3 分組及造模 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、參附注射液低劑量組和高劑量組，每組各10只。采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）［3-4］制備重度膿毒癥大鼠模型，腹腔注射1∶1氯胺酮和甲苯噻嗪溶液或吸入異氟醚麻醉麻醉大鼠后，剃光大鼠腹部，消毒后在無(wú)菌條件下行中線剖腹1～2 cm手術(shù)，暴露盲腸及鄰近腸道，在回盲瓣下方的底部用6.0絲線縫線緊密結(jié)扎，并在盲腸的同一側(cè)用19號(hào)針穿孔1次或2次，然后將盲腸輕輕擠壓以從穿孔部位擠出少量排泄物。盲腸返回腹腔后縫合腹膜及皮膚，皮下注射1 mL預(yù)熱的生理鹽水，使大鼠蘇醒，或放置在加熱墊上，或暴露在150℃的紅外線加熱燈下，直到蘇醒。假手術(shù)組：僅行開腹手術(shù)，不行盲腸結(jié)扎穿孔。

1.4 給藥方法 CLP術(shù)后10 min開始給藥，假手術(shù)組經(jīng)和模型組經(jīng)尾靜脈推注生理鹽水（10 mL/kg），參附低劑量組經(jīng)尾靜脈推注參附注射液5 mL/kg+生理鹽水5 mL/kg，參附高劑量組經(jīng)尾靜脈推注參附注射液10 mL/kg。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 給藥8 h后處死全部動(dòng)物，收集大鼠血液標(biāo)本、腸組織、腸上皮細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。1）炎癥評(píng)分。回腸組織用10%甲醛固定，脫水、透明、包埋、切片、HE染色后顯微鏡下觀察各組回腸組織結(jié)構(gòu)并予以炎癥評(píng)分［5］。2）血清TNF-α、IL-10檢測(cè)。腹主動(dòng)脈取血約2 mL，按照ELISA試劑盒說明檢測(cè)血清中TNF-α、IL-10。3）回腸組織MDA、SOD檢測(cè)。取回腸組織200 mg，剪成細(xì)小的碎片，按照ELISA試劑盒說明檢測(cè)MDA、SOD含量。4）回腸黏膜上皮細(xì)胞的凋亡檢測(cè)。應(yīng)用原位細(xì)胞凋亡法（TUNEL）進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，鏡下隨機(jī)選取10個(gè)絨毛、隱窩，以平均每100個(gè)細(xì)胞所含凋亡細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)即為凋亡指數(shù)（AI）。陽(yáng)性表達(dá)：細(xì)胞核為棕黃色；陰性表達(dá)：細(xì)胞核藍(lán)色為藍(lán)色。5）緊密連接蛋白o(hù)ccludin檢測(cè)：將回腸組織20 mg剪切成細(xì)小的碎片，加入200 μL LRIPA裂解液，用勻漿器勻漿，經(jīng)BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取30 μg總蛋白上樣行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，脫脂封閉2 h，T-TBS緩沖液清洗膜3次，每次30 min，加入多克隆兔抗occludin抗體（一抗）（1∶500）4℃過夜，洗膜3次，再加入HRP標(biāo)記的山羊抗體鼠抗（二抗）孵育2 h，蛋白電泳。用BIO-RAD凝膠系統(tǒng)成像，用quantity one軟件對(duì)條帶進(jìn)行半定量分析。occludin蛋白含量=樣本occludin蛋白灰度值/同一樣本β-actin灰度值。6）Bax、Bcl-2檢測(cè)。取包埋的石蠟組織，采用SABC法進(jìn)行免疫組化染色和DAB顯色法，分別以抗Bax（1∶200）、抗Bcl-2（1∶200）抗體為一抗，其他操作按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布則以（±s）表示。兩組數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)，組間比較用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況比較 假手術(shù)組大鼠精神佳，反應(yīng)靈敏，毛發(fā)光澤，大便正常，腹腔無(wú)腥臭味，腸管無(wú)充血水腫。模型組大鼠精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，食欲差，大便稀，皮毛無(wú)光澤，腹腔可見血性腹水，腥臭味顯著，腸管顯著充血水腫，結(jié)扎的盲腸端呈暗紫色。參附組大鼠精神不佳，反應(yīng)稍遲鈍，食欲欠佳，大便稀，皮毛欠光澤，腹腔可見少許腹水，無(wú)明顯腥臭味，腸管輕度充血水腫，結(jié)扎的盲腸端呈紫色。

2.2 各組大鼠血清TNF-α與IL-10比較 見表1。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α顯著增高（P＜0.05），IL-10顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，參附低、高劑量組TNF-α顯著降低（P＜0.05），IL-10顯著增高（P＜0.05）；與參附低劑量組比較，高劑量組血清TNF-α顯著降低（P＜0.05），IL-10顯著增高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-10水平及回腸組織MDA、SOD表達(dá)比較（±s）

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-10水平及回腸組織MDA、SOD表達(dá)比較（±s）

注：與模型組比較，△P＜0.05；與參附低劑量組比較，*P＜0.05。下同。

組別假手術(shù)組模型組參附低劑量組參附高劑量組n 10 10 10 10 TNF-α（μg/L）13.99±2.85△89.71±14.05 44.69±4.80△29.13±4.69△*IL-10（μg/L）35.60±7.50△28.27±3.15 67.41±6.81△78.97±3.46△*MDA（pg/L）12.28±1.21△25.51±1.29 22.26±1.61△16.48±2.39△*SOD（pg/L）123.28±11.39△62.94±20.71 194.38±53.21△307.77±60.57△*

2.3 各組大鼠回腸組織MDA和SOD表達(dá)比較 見表1。與假手術(shù)組比較，模型組回腸組織MDA明顯增高（P＜0.05），SOD顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，參附低、高劑量組大鼠回腸組織MDA含量降低（P＜0.05），SOD活性增高（P＜0.05）；與參附低劑量組比較，高劑量組MDA含量明顯降低（P＜0.05），SOD活性明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠回腸黏膜形態(tài)學(xué)觀察比較 見圖1，見表2。假手術(shù)組大鼠回腸黏膜絨毛完整，血管周圍無(wú)腫脹及出血，肌層纖維及漿膜層正常。模型組大鼠回腸黏膜絨毛破損，明顯腫脹，可見潰瘍，血管周圍明顯出血，有較多中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，基底層斷裂，Chiu′s評(píng)分較假手術(shù)組顯著增高（P＜0.05）。參附低劑量組、參附高劑量組大鼠回腸黏膜絨毛少量缺損，局限性壞死，少量出血，少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，Chiu′s評(píng)分較模型組顯著降低（P＜0.05）。參附高劑量組較參附低劑量組大鼠回腸黏膜形態(tài)改善更明顯，Chiu′s評(píng)分進(jìn)一步降低（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠回腸黏膜形態(tài)學(xué)觀察比較（HE染色，100倍）

表2 各組大鼠回腸黏膜病理改變Chiu′s評(píng)分和上皮細(xì)胞AI比較（±s）

表2 各組大鼠回腸黏膜病理改變Chiu′s評(píng)分和上皮細(xì)胞AI比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組參附低劑量組參附高劑量組n 10 10 10 10 Chiu′s評(píng)分（分）0.30±0.03△3.80±0.42 3.30±0.48△2.50±0.52△*AI 5.39±1.45△27.21±1.55 18.20±1.29△11.68±1.45△*

2.5 各組大鼠回腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 見圖2，見表2。假手術(shù)組大鼠回腸黏膜上皮僅見少量凋亡細(xì)胞。模型組回腸黏膜上皮凋亡細(xì)胞明顯增加，主要累及黏膜柱狀上皮細(xì)胞和黏膜下層，其AI值顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05）。參附低劑量組和參附高劑量組回腸黏膜上皮細(xì)胞AI值顯著低于模型組（P＜0.05）；參附高劑量組較參附低劑量組回腸黏膜上皮細(xì)胞AI值顯著降低（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠上皮細(xì)胞凋亡比較（TUNEL染色，400倍）

2.6 各組大鼠回腸組織Bax和Bcl-2表達(dá)比較 見表3，圖3～圖4。與假手術(shù)組大鼠比較，模型組大鼠回腸組織促凋亡蛋白Bax顯著增高（P＜0.05），參附低、高劑量組回腸組織Bax均較模型組顯著降低（均P＜0.05），參附高劑量組較參附低劑量組降低更明顯（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠回腸組織抗凋亡蛋白Bcl-2明顯降低（P＜0.05），參附低、高劑量組回腸組織Bcl-2較模型組顯著增高（均P＜0.05）；參附高劑量組較低劑量組增高更明顯（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠回腸組織Bax表達(dá)比較（免疫組化染色，400倍）

圖4 各組大鼠回腸組織Bcl-2表達(dá)比較（免疫組化染色，400倍）

2.7 各組大鼠回腸組織緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)比較 見表3，圖5。與假手術(shù)組大鼠比較，模型組回腸組織緊密連接蛋白o(hù)ccludin顯著降低（P＜0.05），參附低劑量組和參附高劑量組均較模型組明顯升高（P＜0.05），與參附低劑量組比較，參附高劑量組occludin蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。

圖5 各組回腸組織緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)電泳條帶

表3 各組大鼠回腸組織Bax和Bcl-2光密度值和緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠回腸組織Bax和Bcl-2光密度值和緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組參附低劑量組參附高劑量組n 10 10 10 10 Bax 0.31±0.02△0.47±0.14 0.36±0.06△0.30±0.04△*Bcl-2 0.32±0.06△0.24±0.03 0.29±0.05△0.31±0.06△*Bax/Bcl-2 1.06±0.20△0.56±0.18 0.82±0.15△1.06±0.16△*occludin/β-actin 0.36±0.14△0.16±0.07 0.19±0.07△0.36±0.12△*

3 討 論

膿毒癥是因機(jī)體對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)損傷了自身組織而導(dǎo)致的致命性器官功能障礙［6］。膿毒癥發(fā)病率和病死率高，相關(guān)流行病學(xué)顯示，全球范圍內(nèi)已超過1 900萬(wàn)罹患膿毒癥的患者，超過1/4的膿毒癥患者最終死亡，且發(fā)病率呈上升趨勢(shì)［7］。我國(guó)流行病學(xué)資料顯示約33.5%～48.7%膿毒癥患者因嚴(yán)重膿毒癥死亡［8］，其中膿毒癥胃腸功能障礙發(fā)病率及病死率分別為78.8%、61.7%［9］。胃腸道是嚴(yán)重膿毒癥最先、最容易受損的器官之一，是決定疾病的進(jìn)展和預(yù)后的重要因素［10-11］。

有研究顯示，MDA通過裂解腸上皮細(xì)胞DNA，使得腸黏膜上皮細(xì)胞水腫、凋亡增快、緊密連接蛋白減少，從而引起腸道微生態(tài)環(huán)境損壞。所以MDA增高可以間接反映腸組織細(xì)胞損傷程度。SOD是天然的抗氧化酶，它通過阻斷脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)，清除體內(nèi)生成的氧自由基來保護(hù)組織細(xì)胞免受損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，重度膿毒癥時(shí)清除氧自由基的能力明顯下降，而脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象顯著，不同劑量的參附注射液均有抑制脂質(zhì)過氧化，提高清除氧自由基的作用，并與劑量成正相關(guān)。

IL-10主要由單核巨噬細(xì)胞和Th2細(xì)胞分泌，能夠抑制T細(xì)胞增殖和免疫效應(yīng)［12］，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、TNF-α和IL-6等炎癥因子的釋放［13-14］，可以阻斷免疫炎癥發(fā)展過程中的多個(gè)環(huán)節(jié)，具有廣泛的免疫抑制活性。TNF-α是主要由Th1細(xì)胞和活化的單核/巨噬細(xì)胞分泌的一種促炎癥介質(zhì)，是炎癥早期最重要的炎癥介質(zhì)，也是觸發(fā)“炎癥瀑布效應(yīng)”的主要炎癥介質(zhì)。有研究指出高水平的TNF-α和脂多糖可引起肺和腸上皮細(xì)胞的凋亡而導(dǎo)致多臟器功能障礙［15-16］。本研究發(fā)現(xiàn)，參附注射液能通過降低促炎介質(zhì)TNF-α水平，增高抗炎介質(zhì)IL-10水平，減輕或阻斷重度膿毒癥時(shí)過度激活的炎癥反應(yīng)，從而減輕腸黏膜損傷程度，阻止膿毒癥病情的惡化，且作用強(qiáng)度與參附注射液劑量成正比。另外，大鼠CLP手術(shù)8 h后腸黏膜形態(tài)學(xué)發(fā)生顯著改變，腸上皮細(xì)胞凋亡明顯增多。其機(jī)制可能是TNF-α能通過刺激腸微血管內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表達(dá)表面黏附分子，進(jìn)而破壞腸黏膜上皮細(xì)胞及加速腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)重度膿毒癥時(shí)確實(shí)存在著腸上皮細(xì)胞凋亡增多的現(xiàn)象，而應(yīng)用參附注射液對(duì)此有明顯的抑制作用，且其作用強(qiáng)度與參附注射液的劑量成正相關(guān)。江榮林等［17］認(rèn)為參附注射液通過增加氧供應(yīng)、氧輸送、組織氧含量而改善線粒體呼吸功能，增加ATP生成，從而改善腸道功能，抑制腸上皮細(xì)胞凋亡。

Bcl-2和Bax分別是經(jīng)典的抗凋亡和促凋亡成員［18］。Bcl-2/Bax的比值高低是細(xì)胞凋亡的調(diào)控系統(tǒng)，當(dāng)比值增高時(shí)抑制細(xì)胞凋亡，當(dāng)比值下降時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。我們研究發(fā)現(xiàn)，參附注射液通過調(diào)控Bcl-2/Bax的比值來減少腸上皮細(xì)胞凋亡，且這種作用強(qiáng)度與參附注射液的劑量成正相關(guān)。

緊密連接是構(gòu)成腸黏膜機(jī)械屏障最重要組成結(jié)構(gòu)，ocludin是緊密連接蛋白主要組成蛋白，通過與相鄰細(xì)胞之間以拉鏈方式結(jié)合而封閉細(xì)胞間間隙［19-21］。在炎癥因子刺激、缺血缺氧、應(yīng)激等病理情況下跨膜蛋白表達(dá)異常可導(dǎo)致屏障功能破壞和細(xì)胞旁通透性增加，引起腸腔內(nèi)促炎分子的滲透，誘導(dǎo)黏膜免疫系統(tǒng)的激活，導(dǎo)致持續(xù)的炎癥和腸道組織損傷。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，參附注射液可能通過保護(hù)跨膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能完整，維持了腸黏膜屏障的完整性和均一性，阻止了腸道細(xì)菌和毒素的移位。

綜上所述，參附注射通過減少促炎癥介質(zhì)和抗氧化的作用來減少腸黏膜上細(xì)胞的凋亡，維護(hù)腸道緊密連接蛋白來保護(hù)腸道屏障功能。