不同材質的無菌采樣拭子生物相容性研究

關鍵詞：無菌采樣拭子;醫療器械;細胞毒性;口腔刺激;皮膚致敏反應

【中圖分類號】 R197.39 【文獻標識碼】 A ? ? ? 【文章編號】2107-2306（2022）06--06

Abstract： Objective To evaluate the effects of disposable sterile swabs of different materials on cytotoxicity， oral irritation and sensitization， and to provide safety basis and recommendations for disposable sterile swabs in the manufacture and application of medical devices. Methods In this study， disposable sterile swabs made of sponge， medical grade polyamide， and absorbent cotton produced by the same manufacturer were used to evaluate the results in cytotoxicity， oral irritation， and sensitization. In the cytotoxicity test， mouse fibroblast cells L-929 were used for the MTT detection of the extract to calculate the cell survival rate. Oral irritation tests were conducted using 0.9% sodium chloride injection and sesame oil extract samples， soaking cotton balls and stuffing them into the cheek pouch of the golden hamster， observing the erythema reaction on the surface of the cheek pouch， and taking the representative parts of the cheek pouch. Histological evaluation. For sensitization， samples were extracted with 0.9% sodium chloride injection and sesame oil， mixed with Freund’s complete adjuvant to form a stable emulsifier， and injected intracutaneously into the inner part of the scapula of each animal after the challenge. Observe the skin reaction of the sample group and the control group at the time of 24 hour and 48 hours. According to the Magnusson and Kligman grading standards， score the skin erythema and edema reaction of each challenge part. Results The cytotoxicity results showed that the disposable sterile swabs extracts of sponge， medical grade polyamide and absorbent cotton retained a normal appearance after 24 hours of incubation， and there was no significant difference. The MTT results were 83.6%， 80.8% and 84.4% respectively. In the oral irritation test， the oral skin and mucosal reaction of the test group of the three materials did not exceed the oral skin and mucosal reaction of the negative control group. In the sensitization reaction， the skin of the animals in the three groups of sample extract groups was intact， and there was no skin erythema and edema reaction.

Key words： Disposable sterile swabs; Medical device; Cytotoxicity; Oral irritation; Sensitization

一次性無菌采樣拭子作為臨床采集的重要工具，一般用于標本的采集和核酸的檢驗。特別是在2019年新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）爆發后，為了人群的健康篩查，一次性無菌采樣拭子的投入使用大幅提高。無菌采樣拭子在應用時直接與被檢測人的采樣部位接觸，因此，采樣頭材質對人體的生物相容性就尤為重要。如果使用劣質拭子，造成人體過敏或導致結果的假陰性，就會引發其他問題并延誤患者的治療。本研究選取同一廠家生產的三種不同材料的無菌采樣拭子，通過細胞毒性[1]、口腔刺激和致敏反應試驗[2]，評價不同材料的采樣拭子的生物相容性，為無菌采樣拭子在醫療器械制造以及應用方面提供安全依據和建議。

1 材料與方法

1.1材料 一次性無菌采樣拭子（江蘇華夏瑞泰醫療器械有限公司），小鼠成纖維細胞 L-929（美國菌種保存中心（ATCC）），MEM培養基（Hyclone），胎牛血清（Clark），青鏈霉素（Gibco）、，胰蛋白酶（biosharp），PBS（Gibco），MTT（Solarbio），異丙醇（Rhawn），高密度聚乙烯（Hatano Research Institute. FDSC），DMSO（Macklin），福爾馬林固定液（國藥集團化學試劑有限公司），蘇木素染液（碧云天），尹紅染色液（碧云天），鹽酸酒精分化液（Phygene biotechnology Co.， Ltd.），二甲苯（上海凌峰），中性樹膠（索萊寶），弗氏完全佐劑（SIGMA），十二烷基硫酸鈉（SDS）（Solarbio），0.9 %氯化鈉注射液（SC）（廣西裕源藥業有限公司），芝麻油（SO）（浙江田雨山藥用油有限公司）

1.2儀器 CO2 培養箱（Thermofisher Scientific），電子天平（賽多利斯），潔凈工作臺（蘇凈安泰），低速自動平衡離心機（湖南湘儀），Multiskan? Sky酶標儀（Thermofisher Scientific），倒置顯微鏡（含成像）（NIKON）、 立式單門雙層恒溫振蕩箱（Crystal）

1.3實驗動物 金黃地鼠6只，雌雄不限，健康、初成年、雌性未產且無孕，試驗初體重100～120 g，來源于上海市松江區松聯實驗動物場，許可證號：SCXK（滬）2017-0008，每天供給江蘇省協同醫藥生物工程責任有限公司的大小鼠維持飼料。另選30只（試驗組20只、對照組10只）豚鼠（天竺鼠），雌雄不限，健康未使用過的動物，雌性未產且無孕，試驗初體重：300.0～500.0 g，來源于無錫恒泰實驗動物養殖有限公司，許可證號：SCXK（蘇）2020-0003，每天供給江蘇省協同醫藥生物工程責任有限公司的實驗維持豚鼠飼料。飼養環境室溫為18-26 ℃，相對濕度30 %-70 %。

1.4方法

1.4.1浸提液制備 將海綿、醫用級聚酰胺以及脫脂棉制成的無菌采樣拭子分別按照6 cm2/mL的比例浸沒在含血清的培養基中，于37 ℃浸提24小時。另取三種材料的無菌采樣拭子按同樣的比例浸沒于SC（極性浸提介質）和SO（非極性浸提介質）中，于50 ℃浸提72小時。

1.4.2細胞毒性試驗 全程在超凈臺內操作，保證無菌操作過程。將生長至對數生長期的細胞用0.25%的胰蛋白酶（含EDTA）消化，消化后將細胞懸浮液離心（1000 rpm，5分鐘），棄去上清，用MEM培養基重懸細胞，計數得到1×105個/mL 細胞懸液。將細胞懸液以每孔100 μl 接種于96孔板中，并在細胞培養箱（37 ℃，5% CO2，>90%濕度）中培養，鏡下觀察細胞形態。細胞培養板在孵育24小時后棄去孔內原培養基，在相應孔內各加入100 μl浸提液，空白對照（含血清培養基），陰性對照（按3cm2/mL浸提的高密度聚乙烯）和陽性對照（0.1% ZDEC），每組設置六個復孔。重新將96孔板置于細胞培養箱，培養24小時后取出，置于顯微鏡下觀察細胞形態。形態學觀察完畢后去除液體，在每孔中加入50 μl MTT液（終濃度為1 mg/mL），置于二氧化碳培養箱中培養。2小時后去除孔內液體，每孔加入100 μl 異丙醇溶解孔內形成的甲臢，用酶標儀在570 nm波長下測定每孔的吸光度值，計算其細胞毒性。細胞活力%=試驗（或陽性及陰性）樣品組OD570 /空白對照組OD570×100%。若細胞活力%<空白組的70%，說明樣品具有潛在的細胞毒性。

1.4.3口腔刺激試驗 將18只金黃地鼠依據不同材料的試驗樣品，按照完全隨機分成極性浸提組和非極性浸提組，每組3只。翻轉金黃地鼠頰囊用生理鹽水沖洗后，檢查有無異常。取樣品浸提液浸透適宜大小的棉球，放入動物的一側頰囊內，另一側頰囊放入浸透同種浸提介質的棉球作為對照。接觸時間為5 min，接觸后除去棉球，用生理鹽水沖洗頰囊，應注意不要污染另一側頰囊。重復上述步驟每小時1次（±0.1 h），共4 h。按表1的記分系統，判斷動物每一觀察期頰囊表面紅斑反應情況并記分，每一觀察記分相加后再除以觀察總數得出每只動物平均記分。取頰囊有代表性部位的組織樣品放入10%福爾馬林中固定后用顯微鏡進行組織學評價，可按表2規定的記分系統對每一組織進行評分，試驗組平均記分減去陰性對照組平均記分得出刺激指數，見表3。

1.4.4皮膚致敏試驗 85只豚鼠按照完全隨機分成樣品極性浸提組（三種材料每組10只）、樣品非極性浸提組（三種材料每組10只）、極性溶劑對照組（5只）和非極性溶劑對照組（5只）、陽性對照組（2，4-二硝基氯苯（DNCB）10只）、陽性溶劑對照（（無水乙醇）5只）。皮內誘導階段，在豚鼠去毛的肩胛骨內側部位A、B、C三點成對注射0.1 mL配置的溶液。部位A：弗氏完全佐劑與選定的溶劑以50：50（V/V）比例混合的穩定性乳化劑。部位B：動物分別注射試驗樣品浸提液或陰性對照液。部位C：試驗樣品（部位B中采用的濃度），以50：50的體積比例與弗氏完全佐劑與溶劑（50%）配制成的乳化劑混合后進行皮內注射;對照組動物注射對照液與佐劑配制成的乳化劑。注射7天后去除每只動物的試驗區被毛進行局部誘導，在激發前24小時用10% SDS處理。在注射部位將SDS按摩導入皮膚產生輕微的急性炎癥反應。SDS處理后第2天，用紗布輕輕清除殘留的SDS。試驗組按部位B中選定的濃度，采用面積約8 cm2的敷貼片在新鮮制備的樣品浸提液浸透后局部貼敷于每只動物的肩胛骨內側部位，覆蓋誘導注射點。用封閉式包扎帶固定敷貼片，并于48小時后除去包扎帶和敷貼片。激發前1天，去除動物一側腹背部的被毛。于局部誘導階段后14天，將吸收性紗布塊置于試驗樣品浸提液和對照液中浸透，分別貼敷于每只動物的腹背部去毛區（誘導階段未試驗部位）。用封閉式包扎帶固定，并于24小時后除去包扎帶和敷貼片。除去樣品后24小時和48小時，分別觀察供試品組和對照組動物激發部位皮膚情況，在全光譜光線下觀察皮膚反應，按Magnusson和Kligman分級標準對每一激發部位和每一觀察時間皮膚紅斑和水腫進行描述并分級。如果對照組動物等級小于1，而試驗組中等級大于或等于1時一般提示致敏。如對照組動物等級大于或等于1時，試驗組動物反應超過對照組中最嚴重的反應則認為致敏。

1.5統計方法 數據表示為mean±SD，利用 Excel 軟件對動物實驗進行分組，分組方法采用完全隨機設計。

2 結果

2.1細胞毒性試驗 海綿、醫用級聚酰胺以及脫脂棉制成的一次性無菌采樣拭子在與細胞接觸24小時后在顯微鏡下均可見胞漿內離散穎粒，無細胞溶解和細胞增殖下降情況，見圖1。細胞存活率分別為83.0%，81.2%和84.2%，均大于70%，無潛在的細胞毒性，且各材料制成的無菌采樣拭子在細胞毒性方面無顯著性差異，見表4和圖2。

皮膚致敏試驗 除去樣品后24和48小時，試驗樣品組與陰性對照組豚鼠均未出現死亡及其他異常情況，且各材料制成的無菌采樣拭子均未導致皮膚紅斑或水腫現象，動物皮膚完好，反應分級為0級，在致敏試驗中沒有皮膚致敏作用，見表8，圖4。

3 討論

醫療器械按照其與人體接觸時間和接觸性質可依據風險分為表面接觸、外部接入和植入類的器械。一次性無菌采樣拭子作為短期和粘膜進行接觸的一類醫療器械在臨床上應用十分廣泛，一般用于流感等呼吸道及腸道病毒的鼻部及咽喉部采樣，能夠容易且舒適地將病人的脫落細胞提取出來，并可以完整、快速將采集患者病灶處的上皮脫落細胞脫離釋放到細胞保存液中。同時，隨著新型冠狀病毒疫情的大爆發，通過鼻咽拭子標本進行病毒核酸檢測是目前疫情防控的重要手段之一，能夠更高效便捷地進行人群全面篩查。

由于一次性無菌采樣拭子是直接與人體鼻咽部粘膜接觸，其生物安全性的評價就尤為重要，而市面上制成無菌采樣拭子的材料有許多種，包括海綿、人造絲拭子、植絨拭子、棉簽等等。因此，本研究選取海綿、聚酰胺和脫脂棉三種材質的拭子，柄部均為ABS，觀察不同材料的拭子對于生物相容性的影響。

《新冠病毒核酸10合1混采檢測技術規范》規定采樣拭子宜選用聚酯、尼龍等非棉質、非藻酸鈣材質的拭子，且柄部為非木質材料，折斷點位于距拭子頭頂端3cm左右，易于折斷[3]。合成纖維棉簽更適用與病毒采樣，因為海藻酸鈣拭子或木柄拭子可能含有使某些病毒失活并抑制PCR測試的物質，從而導致結果不準確[4]。尼龍植絨材質相比于棉簽，柔軟吸水性好，能夠快速釋放樣本，易折斷且方便運輸保存。植絨拭子桿比較軟，拭子頭較細，相比于人造纖維材質的拭子更適合兒童鼻咽部的采集。此外，郭艷飛[5]發現相比于海棉拭子和棉簽拭子，植絨拭子采樣后具有更高的洗脫微生物效率，有利于表面微生物的收集。在本研究中，海棉拭子、聚酰胺拭子和脫脂棉拭子均無細胞毒性、口腔刺激性以及皮膚致敏反應，且三種材料結果相近。因此，不同材質的采樣拭子均有良好的生物相容性，但如何選擇因根據臨床應用和實際情況進行決定。

參考文獻：

[1]GB/T 16886.5-2017醫療器械生物學評價第5部分：體外細胞毒性試驗[S].2017.

[2]GB/T 16886.10-2017醫療器械生物學評價第10部分：刺激與皮膚致敏試驗[S].2017.

[3]新冠病毒核酸10合1混采檢測技術規范[J]. 中國病毒病雜志，2020，10（05）：330-332

[4]CDC： Coronavirus Disease 2019 （COVID-19）： Interim Guidelines for Collecting， Handling， and Testing Clinical Specimens from Persons Under Investigation （PUIs） for Coronavirus Disease 2019 （COVID-19）. CDC website. Updated March 9， 2020. Reviewed March 9， 2020. Accessed March 12， 2020.

[5]郭艷飛. 不同采樣拭子材質和洗脫方式對表面微生物收集的影響[J]. 中國醫藥指南，2021，19（04）：24-26.

作者簡介：王霄彤，1994年6月，女，江蘇蘇州，助理工程師，中檢華通威國際檢驗（蘇州）有限公司，醫療器械生物相容性檢測