鼻腔路徑PM2.5暴露致大鼠中耳炎癥及聽(tīng)力損傷的研究

管燕平 田書心 王碧旭 田成華 丁志山 周芳美

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053

近年來(lái)隨著我國(guó)工業(yè)化進(jìn)程加快，大氣細(xì)顆粒物（particulate matter 2.5，PM2.5）污染日趨嚴(yán)重，因其粒徑小、比表面積大，表面往往吸附較多有害物質(zhì)。大量研究表明，PM2.5成分復(fù)雜，主要包括微量重金屬元素、碳類顆粒、多環(huán)芳烴類和生物性物質(zhì)[1]，由人體吸入后，可永久停于體內(nèi)，嚴(yán)重?fù)p害呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等，并可增加耳鼻咽喉疾病的發(fā)病率[2-3]。

Zhang等[4]研究證明，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起的中耳炎癥破壞了內(nèi)耳液體平衡，顯著影響了對(duì)內(nèi)耳內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要的血管紋內(nèi)淋巴-血液屏障，而PM2.5吸附的多種病原微生物含有LPS成分，這提示PM2.5暴露可能與中耳炎癥有著密切關(guān)聯(lián)，并可能導(dǎo)致聽(tīng)力損失。目前研究顯示，城市空氣顆粒、沙塵、吸煙煙霧等吸入性顆粒物可以導(dǎo)致中耳組織病理學(xué)改變，促進(jìn)中耳炎的發(fā)展[5-9]，但PM2.5對(duì)中耳聽(tīng)力的影響尚未進(jìn)行深入探究。

本實(shí)驗(yàn)以SD大鼠為研究對(duì)象，通過(guò)檢測(cè)大鼠中耳腔內(nèi)相關(guān)炎癥因子表達(dá)、組織病理學(xué)改變以及聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路指標(biāo)變化，旨在探討鼻腔路徑PM2.5暴露與短期聽(tīng)力損傷之間的聯(lián)系及其相關(guān)機(jī)制，為聽(tīng)力損失防治研究提供新的線索。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)健康雄性SD大鼠32只，共64耳，聽(tīng)力正常，體質(zhì)量（200±10）g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)碼：SCXK（滬）2017-0005]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2018-0012]。 將大鼠隨機(jī)分為8組，正常對(duì)照組進(jìn)一步分為第1、3、5、14天處死組，PM2.5染毒組同樣分為第1、3、5、14天處死組，每組各4只，共8耳。

1.2 主要儀器和試劑 石英膜購(gòu)于英國(guó)沃特曼公司（批號(hào)：1831032）； 髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒、 白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒均購(gòu)于上海鈺博生物有限公司（批號(hào)：202002、201912）；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）ELISA 試劑盒購(gòu)于北京欣博盛生物有限公司（批號(hào)：40031）；粘蛋白5AC（mucin-5 subtype AC，MUC5AC）ELISA試劑盒購(gòu)于CUSABIO生物有限公司（批號(hào)：K13012031）；大鼠γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ） CBA Flex Set A6和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）CBA Flex Set C8檢測(cè)試劑均購(gòu)于美國(guó)BD公司（批號(hào)：9255717、9221625）。

Thermo Anderson G-2.5型 PM2.5大流量空氣采樣儀購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司；美國(guó)智聽(tīng)SMART EP聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位為上海涵飛醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；Interacoutics Titan-IMP440中耳分析儀購(gòu)于上海奧迪康國(guó)際貿(mào)易有限公司；Biosciences Accuri C6流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.3 方法

1.3.1 PM2.5懸液制備 在浙江中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)樓樓頂 （距離地面約20 m），采用PM2.5大流量空氣采樣儀，以5 L·min-1流量進(jìn)行采樣，連續(xù)采樣3 d。將采樣膜剪成1 cm×1 cm大小，置于絲口瓶中，加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）至完全沒(méi)過(guò)采樣膜碎片，避光放入搖床，200 r/min充分洗脫24 h。超聲震蕩30 min后，洗脫液以8層無(wú)菌紗布過(guò)濾，真空冷凍干燥后獲得PM2.5全顆粒物樣品，-80℃避光保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)前用PBS配制成15 mg·mL-1懸液，超聲20 min后使用。

1.3.2 鼻腔路徑染毒方法 大鼠以1%戊巴比妥鈉40 mg·kg-1腹腔注射麻醉，并固定于固定架上。結(jié)合咽鼓管特殊解剖位置[10-12]，在內(nèi)鏡下采用軟腭正中入路，在鼻咽部近鼻腔后端的軟腭正中進(jìn)針，PM2.5染毒組按1 mL·kg-1劑量將PM2.5懸液注射于咽鼓管開(kāi)口附近，正常對(duì)照組注入1 mL·kg-1的PBS。兩組連續(xù)干預(yù)7 d，于干預(yù)后第1、3、5、14天各處死4只大鼠進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.3 鼓膜形態(tài)觀察及聽(tīng)力學(xué)測(cè)試 充分麻醉大鼠，清除外耳道耵聹，借助電耳鏡觀察鼓膜形態(tài)；采用聲導(dǎo)抗儀行鼓室圖測(cè)試，探測(cè)音頻率為226 Hz，壓力變化范圍為+200～-200 daPa（1 daPa=10 Pa），泵速為50 daPa·s-1，采用自制硅膠耳塞，適當(dāng)調(diào)整探頭，使之與外耳道緊密嵌合，確保聲漏較少，記錄鼓室聲導(dǎo)納值及峰壓值。

1.3.4 聽(tīng)性腦干誘發(fā)電位（auditory brainstem response，ABR） 采用針灸針電極，記錄電極置于顱頂矢狀縫正中與雙側(cè)外耳道連線的交點(diǎn)，參考電極置于雙側(cè)耳后皮下，接地電極置于鼻根。Click聲刺激，刺激速率13.1次·s-1，濾波范圍50～3 000 Hz，疊加1 024次，測(cè)試以10 dB nHL為梯度，自40 dB nHL依次降低強(qiáng)度，接近閾值處以5 dB nHL為步距進(jìn)行刺激，若Ⅲ波消失，則上升5 dB nHL重復(fù)兩次，以判斷反應(yīng)閾值。

1.3.5 炎癥因子水平檢測(cè) 消毒大鼠耳部，剪除外耳，暴露中耳，以PBS反復(fù)灌洗雙側(cè)中耳各4次，收集中耳灌洗液（middle ear lavage fluid，MELF），以1 000 r/min離心5 min，收集上清液。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)MELF上清液中VEGF、MPO、MUC5AC和IL-6水平；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TNF-α、IFN-γ水平。

1.3.6 中耳組織切片觀察 取大鼠一側(cè)聽(tīng)泡，4%多聚甲醛固定24 h，10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液脫鈣至骨質(zhì)軟化，經(jīng)梯度乙醇脫水后，石蠟包埋切片，常規(guī)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，光鏡下觀察中耳黏膜增生及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以Graphpad Prism 7.0軟件進(jìn)行圖表分析，計(jì)量資料以x±s表示，兩組組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間不同時(shí)間點(diǎn)比較采用雙因素重復(fù)測(cè)量方差分析。兩兩比較方差齊時(shí)采用Befforoni檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠鼓膜形態(tài)變化比較 第1～14天正常對(duì)照組鼓膜形態(tài)完好，可見(jiàn)明顯光錐。PM2.5染毒組大鼠染毒后第1、14天鼓膜形態(tài)變化不大；第3天可見(jiàn)鼓膜表面充血內(nèi)陷，光錐消失，其中2耳存在輕度中耳積液；第5天可見(jiàn)鼓膜表面渾濁暗淡，其中4耳存在中耳積液。

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠鼓室圖測(cè)試變化比較 與染毒前比較，染毒后第3、5天PM2.5染毒組大鼠聲導(dǎo)納值明顯下降（P＜0.01，P＜0.0001），峰壓值低于正常范圍（-50～+50 daPa）；與正常對(duì)照組比較，峰壓值顯著下降（P＜0.0001）。見(jiàn)表1。染毒后第1天峰壓值有所下降，但未超出正常范圍，為A型鼓室圖，第3天有2耳為B型（平坦型）鼓室圖，第5天共4耳為B型（平坦型）鼓室圖，其余均為C型（負(fù)壓型）鼓室圖。正常對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)參數(shù)均在正常范圍內(nèi)，均為A型鼓室圖。

表1 各組大鼠造模前后聲導(dǎo)納、峰壓值比較Tab.1 The changes of acoustic admittance and peak pressure before and after nasal route modeling in each group

2.3 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠ABR變化比較 PM2.5染毒組染毒后第3、5天反應(yīng)閾值顯著升高（P＜0.01），染毒后第1、14天反應(yīng)閾值均在正常范圍內(nèi)；正常對(duì)照組染毒前后ABR反應(yīng)閾值相對(duì)穩(wěn)定，均在誤差范圍內(nèi)。與染毒前比較，PM2.5染毒組40 dB nHL處Ⅲ波潛伏期在染毒后第3、5天延遲（P＜0.05，P＜0.001），第1、14天潛伏期無(wú)明顯變化；正常對(duì)照組染毒前后40 dB nHL處潛伏期相對(duì)穩(wěn)定，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠造模前后反應(yīng)閾值、40 dB nHL處Ⅲ波潛伏期變化Tab.2 Changes of response threshold and latency of wave Ⅲ at 40 dB nHL before and after modeling in each group

2.4 各組大鼠中耳黏膜VEGF、MPO、MUC5AC水平比較 與正常對(duì)照組比較，PM2.5染毒組大鼠染毒后第3、5天，VEGF水平均升高（P＜0.01）；MPO和MUC5AC水平均顯著升高（P＜0.0001）。 VEGF、MPO、MUC5AC水平均于第5天達(dá)到高峰，而后呈下降趨勢(shì)；染毒后第14天，各指標(biāo)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠VEGF、MPO、MUC5AC表達(dá)情況Fig.1 The expression of VEGF，MPO and MUC5AC in each group

2.5 各組大鼠中耳炎癥因子表達(dá)比較 與正常對(duì)照組比較，PM2.5染毒組大鼠染毒后第3、5天，IL-6、TNF-α、IFN-γ水平均不同程度升高 （P＜0.01，P＜0.001，P＜0.0001），于第3或5天達(dá)到高峰后呈緩慢下降趨勢(shì)；染毒后第14天，各指標(biāo)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠MELF炎癥因子表達(dá)比較Fig.2 Expression of inflammatory factors in MELF in each group

2.6 大鼠中耳黏膜病理改變比較 HE染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組鼓室黏膜為單層上皮細(xì)胞，無(wú)明顯破壞，無(wú)明顯炎癥反應(yīng)。與正常對(duì)照組比較，PM2.5染毒組大鼠染毒后第1天中耳黏膜形態(tài)基本正常；第3、5天中耳黏膜厚度顯著增加，第5天尤為明顯，中耳上皮細(xì)胞排列紊亂，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，伴黏膜纖毛脫落；第14天中耳黏膜厚度降低，但仍略有增厚。見(jiàn)圖3。

圖3 鼻腔路徑染毒大鼠中耳黏膜形態(tài)學(xué)改變（HE染色，400×）Fig.3 Morphological changes of middle ear mucosa in rats exposed to nasal route(HE staining，400×)

3 討論

已有研究顯示，大氣顆粒物污染會(huì)影響耳科疾病的發(fā)生與發(fā)展[13]。PM2.5作為重要的大氣顆粒物污染之一，因其粒徑小，比表面積大，極易富集重金屬、病原微生物、多環(huán)芳烴等有害物質(zhì)，又因其滲透性強(qiáng)，沉積于細(xì)小支氣管分支和肺泡的速度極快[14]。以往研究多集中于PM2.5對(duì)呼吸與心血管系統(tǒng)的影響，針對(duì)PM2.5與聽(tīng)力關(guān)系的研究寥寥可數(shù)。眾所周知，中耳是一個(gè)含氣空腔，外以鼓膜接外耳道，前經(jīng)咽鼓管與鼻咽腔相通，易受細(xì)菌、病毒感染以及顆粒物損傷，引起中耳功能受損。鼻腔作為呼吸道防御的第一道門戶，首先接觸空氣中的PM2.5，進(jìn)而發(fā)生吸附、吸收反應(yīng)。經(jīng)鼻呼吸時(shí)，纖毛和黏液對(duì)大多數(shù)直徑超過(guò)10 μm的顆粒物起著非常有效的過(guò)濾作用[14]，而PM2.5的大小與細(xì)菌相似，可能經(jīng)過(guò)鼻纖毛向后輸送，導(dǎo)致咽鼓管咽口水腫和鼻咽部感染逆行入中耳。本研究通過(guò)軟腭正中入路染毒，模擬鼻腔路徑PM2.5暴露，研究PM2.5對(duì)于聽(tīng)力的影響，并探討其作用機(jī)制。

鼓室聲導(dǎo)抗對(duì)分泌性中耳炎的診斷價(jià)值已被國(guó)內(nèi)外學(xué)者所肯定，具有特異度和靈敏度高等特點(diǎn)。大鼠鼻腔路徑染毒后第3、5天后聲導(dǎo)納值顯著降低，峰壓值向負(fù)值方向變化，提示大鼠中耳的聲能量傳導(dǎo)特性發(fā)生改變，導(dǎo)致中耳腔吸收的聲能量減少，這可能與PM2.5引起的咽鼓管阻塞以及而后導(dǎo)致中耳腔內(nèi)的炎性變化有關(guān)。咽鼓管功能障礙，中耳內(nèi)外壓力平衡功能失調(diào)，產(chǎn)生中耳負(fù)壓，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，染毒后第3、5天的鼓室圖為B型（平坦型）和C型（負(fù)壓型）。文獻(xiàn)顯示，B型鼓室圖為典型的鼓室積液圖，C型鼓室圖提示咽鼓管功能不良或阻塞，中耳氣體被吸收形成負(fù)壓，導(dǎo)致鼓膜內(nèi)陷，兩者都與分泌性中耳炎有密切關(guān)系[15]。同時(shí)電耳鏡可見(jiàn)，染毒后第3、5天鼓膜表面渾濁，出現(xiàn)中耳積液，2周后均出現(xiàn)代償趨勢(shì)，說(shuō)明這是一種急性損傷，有緩慢自愈的特點(diǎn)。此外，本研究采用以Click聲為刺激聲的聽(tīng)性腦干反應(yīng)測(cè)試，該項(xiàng)測(cè)試瞬態(tài)特異性好，波形分化清晰，在一定程度上可評(píng)估聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路的功能變化[16]。與染毒前相比，鼻腔路徑染毒后第3、5天ABR反應(yīng)閾值和40 dB nHL處Ⅲ波潛伏期上升明顯，這提示聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路出現(xiàn)異常，聲能量到達(dá)聽(tīng)皮層的時(shí)間延長(zhǎng)[17]。聽(tīng)功能的變化可能與中耳的阻抗調(diào)節(jié)系統(tǒng)損傷有關(guān)[18]，PM2.5染毒后經(jīng)咽鼓管作用于中耳，導(dǎo)致急性炎癥損傷，產(chǎn)生鼓室積液，阻滯聲信號(hào)傳導(dǎo)，使得進(jìn)入內(nèi)耳的聲能量減少；聽(tīng)功能的下降亦可能與PM2.5的毒性作用有關(guān)，致使血管紋內(nèi)淋巴-血液屏障出現(xiàn)障礙，聽(tīng)覺(jué)通路功能下降。

本研究聯(lián)合運(yùn)用鼓室圖測(cè)試和聽(tīng)性腦干反應(yīng)測(cè)試檢測(cè)大鼠聽(tīng)功能變化，使結(jié)果更具有參考性。結(jié)果證明，鼻腔路徑PM2.5染毒后第3、5天大鼠聽(tīng)力損傷明顯，第14天好轉(zhuǎn)。本研究進(jìn)一步探究了可能的機(jī)制，中耳炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致中耳功能損傷的主要原因之一，TNF-α、IL-6、IFN-γ等炎癥因子是造成急性中耳炎的分子基礎(chǔ)。研究表明，TNF-α可通過(guò)核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路誘導(dǎo)炎性因子的分泌，從而加速炎癥反應(yīng)[19]；IL-6可促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖，延長(zhǎng)炎癥反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間[20]。中耳炎時(shí)兩者均可促使中耳腔組織結(jié)構(gòu)重塑，誘導(dǎo)骨質(zhì)破壞，導(dǎo)致中耳損傷[21]。IL-6還可以作為誘導(dǎo)因子，誘導(dǎo)機(jī)體分泌VEGF，促進(jìn)血管新生和炎癥發(fā)展[22]。IFN-γ是Th1型輔助T細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子，可由巨噬細(xì)胞等分泌，作為強(qiáng)大的前炎癥因子激活局部炎癥反應(yīng)[23]。本研究結(jié)果顯示，鼻腔路徑染毒后第3、5天，PM2.5染毒組大鼠MELF中IL-6、TNF-α、IFN-γ表達(dá)均不同程度升高，后期呈緩慢下降趨勢(shì)，至第14天與正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示鼻腔路徑PM2.5染毒后第3、5天，中耳黏膜組織發(fā)生炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

鼻腔路徑VEGF、MPO的表達(dá)在染毒后第3、5天均升高，達(dá)到高峰后呈緩慢下降趨勢(shì)。VEGF是作用最強(qiáng)的促血管生成細(xì)胞因子，能夠特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞增殖、出芽、遷移，誘導(dǎo)血管生成，增加血管通透性[24]，其表達(dá)的增加會(huì)加重中耳黏膜水腫，增加炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，加劇中耳炎癥，已證實(shí)與耳蝸功能和聽(tīng)力損失密切相關(guān)[25]。MPO是一種血紅素蛋白，富含于中性粒細(xì)胞中，是中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的重要指標(biāo)，可促進(jìn)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的分泌，同時(shí)與單核細(xì)胞結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞因子分泌，加重炎性損傷[26-27]。本研究選用VEGF、MPO為指標(biāo)，側(cè)面反映大鼠中耳黏膜的炎性改變。MUC5AC是中耳積液中積聚的主要粘蛋白，存在于黏膜表面，起著保護(hù)和潤(rùn)滑上皮作用，并且通過(guò)對(duì)病原體的黏附，發(fā)揮防御作用[28-29]。鼻腔路徑MUC5AC的表達(dá)在染毒后第3、5天均顯著升高，而后不斷下降，證明PM2.5染毒所造成的急性炎癥損傷伴有一定程度中耳積液，而后緩慢吸收。中耳組織切片HE染色結(jié)果顯示鼻腔PM2.5暴露可以誘導(dǎo)中耳黏膜增厚、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等特征性形態(tài)學(xué)改變，2周后緩慢趨于正常，直觀反映了大鼠中耳黏膜的急性炎癥改變和自愈過(guò)程，與Chang等[8]和Park等[30]研究結(jié)果相符。

綜上所述，本研究初步證實(shí)了鼻腔路徑PM2.5暴露可導(dǎo)致大鼠中耳急性炎性損傷并伴有積液滲出，引起聽(tīng)力功能損失。本研究結(jié)果將為聽(tīng)力損失防治研究提供新的線索，在臨床診斷和治療中具有借鑒價(jià)值。深入探討大氣PM2.5對(duì)聽(tīng)覺(jué)功能的危害，對(duì)提高人群的健康水平具有較重要的現(xiàn)實(shí)意義。