基于CD40/NF-κB通路丹皮酚調控miR-145抑制小鼠動脈粥樣硬化泡沫細胞炎癥反應

劉 玲，蔣婷婷，楊宇龍，施曉艷，劉雅蓉，吳鴻飛，戴 敏

(安徽中醫藥大學藥學院 安徽省中藥研究與開發重點實驗室，安徽 合肥 230012)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性炎癥性疾病，炎癥反應貫穿AS發展的始終[1]，巨噬細胞通過清道夫受體CD36攝取氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)形成巨噬細胞源性泡沫細胞，泡沫細胞分泌炎癥因子加劇AS的發生與發展[2]。AS炎癥的發生與多種微小RNA(micro RNA，miRNA)有關，miR-145在巨噬細胞上均有分布，且在AS斑塊中低表達[3]。在病理情況下，它的下游靶基因CD40在巨噬細胞上高度表達，與受體結合后可以激活下游核轉錄因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)通路，導致炎癥因子白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)的釋放[4-5]。

丹皮酚(paeonol，Pae)為毛茛科植物牡丹PaeoniaSuffruticoasAndr.干燥根皮的主要活性成分之一，具有抗炎、抗AS作用[67]。但是Pae抗泡沫細胞炎癥作用機制尚不清楚。本課題組采用高脂飼料飼養ApoE-/-小鼠復制AS模型，從整體動物水平觀察Pae對主動脈miR-145表達的影響及其抑制血管泡沫細胞炎癥的作用；進一步采用ox-LDL刺激RAW264.7細胞建立巨噬細胞源性泡沫細胞炎癥模型，從細胞水平探討Pae是否通過影響miR-145的表達，抑制CD40/NF-κB通路，從而發揮抑制泡沫細胞炎癥反應的作用。

1 材料

1.1 動物 SPF級健康雄性ApoE-/-和C57BL/6J小鼠，體質量為(20±5)g，7～8周齡，常州卡文實驗動物有限公司提供，生產許可證號：SCXK(蘇)2019-0001，實驗動物在(21±1)℃、相對濕度50%～60%的環境下進行飼養，飼養期間給予高脂飼料。

1.2 RAW264.7細胞 RAW264.7細胞購于中國科學院上海生命科學研究院細胞庫，培養于DMEM培養基(含10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素)，37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下，每隔1 d傳代一次。

1.3 藥物與試劑 Pae(批號T2012218，純度99%)：宣城百草藥業有限公司；ox-LDL(批號1805P210642)：上海懋康生物科技有限公司；油紅O染色液(批號20201113)：北京索萊寶科技有限公司；白細胞分化抗原40(clusters of differentitation 40，CD40)、磷酸化核轉錄因子-κB p65(p-NF-κB p65，p-p65)(批號C69G12、C74G24)：美國Cell Signaling Technology公司；CD36(批號18426685)：Santa Cruz Biotechnology；Lipofectamine?2000試劑(批號2267372)：美國Invitrogen生命技術公司；IL-1、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒(批號JL20050002、JL20040001、JL20050001)：美國酶免公司。

1.4 儀器 電子精密分析天平：上海精密科學儀器公司；熒光顯微鏡：日本Olympus公司；石蠟切片機：德國Leica公司；移液槍：美國Eppendorf公司；多功能酶標儀：美國MD公司；低溫臺式離心機：美國Thermo公司；實時熒光定量PCR檢測儀(M×3000P)：Agilent Technologies Stratagene。

2 方法

2.1 動物分組及給藥 將ApoE-/-小鼠隨機分為3組：模型組和Pae中、高劑量組，每組6只，給予高脂飼料喂養，高脂飼料配方為20%蛋白質、50%碳水化合物、21%脂肪、0.15%膽固醇。另取6只C57BL/6J小鼠為空白組，普通飼料喂養。Pae組灌胃給予Pae溶液(200、300 mg/kg)，其余兩組灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，給藥容積均為10 mL/kg。

2.2 油紅O染色觀察主動脈病理學變化 第20周末，動物禁食、處死，預冷PBS沖洗小鼠心臟及主動脈血管組織，使用纖維剪將心臟去除，在體式顯微鏡下觀察，用顯微鑷及顯微剪將血管外膜上附著的脂肪及其他組織分離去除，用顯微剪將血管縱向剖開。平鋪整根主動脈，用細針將其固定于黑色培養皿上，油紅O工作液染15 min，分別用100%和65%異丙醇分化5 min，采用高分辨率相機拍照，以斑塊占總血管面積的百分比代表AS的相對嚴重程度。

2.3 激光共聚焦顯微鏡觀測主動脈免疫熒光蛋白CD36、CD40 采用免疫熒光雙染CD36與CD40蛋白，即紅色熒光與綠色熒光共定位的紅色熒光部分占綠色熒光區域面積的系數，以此檢測并比較各組主動脈巨噬細胞源性泡沫細胞中CD40的表達水平。將預先放入-80 ℃的主動脈病理切片，放置室溫復溫，加入4%多聚甲醛固定30 min，使用0.1% TritonX-100通化細胞，加入5%羊血清浸潤封閉后按照說明書分別加入相應的特異性一抗、二抗；37 ℃恒溫箱中孵育1 h取出后，加入DAPI在室溫下孵育10 min，對細胞核進行染色，加入防猝滅劑，在激光共聚焦顯微鏡下觀察兩種蛋白染色情況并拍照。

2.4 RT-PCR檢測miR-145表達水平 50 ～100 mg主動脈或培養板中每孔加入1 mL的Trizol，用移液槍反復吹打80次，移入無酶的1.5 mL的EP管中，室溫靜置5 min，每管加入200 μL的氯仿，劇烈搖15 s，12 000 r/min離心15 min，取EP管中最上層，加入等容積的氯仿， 10 000 r/min離心10 min，加入75%乙醇，10 000 r/min離心10 min，棄上清，用濾紙吸干殘余液體，加20 μL DEPC水溶解白色沉淀。測定RNA濃度后，按照SYBR Green PCR試劑盒說明書進行RT-PCR。miR-145上游引物是5′-CGGTCCAGTTTTCCCAGGA-3′，下游引物是5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′，U6上游引物是5′-GTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，下游引物是5′-ATGGAACGCTTCACGAATTTG-3′，采用2-ΔΔCT法計算miR-145表達水平。

2.5 ELISA法檢測IL-1、IL-6、TNF-α水平 將小鼠麻醉后暴露腹腔，定位腹主動脈并取血，4 000 r/min離心15 min，分離上層血清，EP管分裝或將RAW264.7細胞懸液接種于6孔板中，進行分組后，收集各組細胞的上清液，采用ELISA法，在450 nm波長下測量各孔的A值，計算血清IL-1、IL-6、TNF-α水平。

2.6 細胞培養及分組 RAW264.7細胞用含10% FBS的DMEM高糖培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，細胞每隔1 d更換新鮮的培養基，待細胞密度達到80%～90%時，用胰酶消化，進行后續實驗。

將RAW264.7(1×105/mL)接種于6孔板中，每孔含有2 mL培養基，在37 ℃、5% CO2細胞培養箱中孵育，根據Lipofectamine?2000轉染試劑盒說明書將miR-145模擬劑和miR-145抑制劑轉染入細胞12 h后，給予Pae預保護24 h，更換含ox-LDL的高糖DMEM細胞培養基，在37 ℃、5% CO2細胞培養箱中孵育，備用。等到RAW264.7融合度約達到80%時，終止細胞培養，用細胞刮輕輕地刮取細胞，以提取RAW264.7的總蛋白，將實驗分成7組。①空白組；②模型組：加入ox-LDL(80 μg/mL)；③Pae組：加Pae(60 μmol/L)；④miR-145模擬劑組：轉染miR-145模擬劑后，加ox-LDL；⑤miR-145抑制劑組：轉染miR-145抑制劑后，加ox-LDL；⑥Pae+miR-145模擬劑組：轉染miR-145模擬劑后，再加入Pae和ox-LDL；⑦Pae+miR-145抑制劑組：轉染miR-145抑制劑后，加Pae和ox-LDL；每組設3個復孔。

2.7 細胞毒性檢測試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)檢測細胞毒性 將RAW264.7細胞混懸液(1×105/mL)接種于96孔板中培養，加入含有不同濃度(10、20、40、80、160 μmol/L)的ox-LDL培養液100 μL的細胞為實驗組，另設不含ox-LDL刺激劑的培養液的細胞為正常對照組，只有培養液的為空白組，分別在細胞培養箱中培養24 h，CCK8法檢測細胞吸光度(A)。細胞存活率=(A實驗組-A空白組)/A正常對照組×100%。得到ox-LDL刺激RAW264.7細胞的最佳濃度。

每孔預先給予含不同濃度(15、30、60、120、240 μmol/L)Pae的培養液100 μL，分別置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱12 h，采用CCK-8法測定A值。細胞存活率=(A實驗組-A空白組)/(A正常對照組-A空白組)×100%。得出Pae保護RAW264.7細胞的最佳濃度。

2.8 油紅O觀察細胞的荷脂情況 用異丙醇配置5%油紅O儲備液備用，細胞用PBS洗2次，4%的多聚甲醛固定30 min，油紅O儲備液經濾紙過濾后與去離子水按3∶2比例稀釋成工作液，染色30 min，用PBS清洗，顯微鏡下觀察脂質蓄積情況。

2.9 Western blot法檢測CD40和p-p65水平 棄去細胞培養液，用PBS沖洗細胞3次，加上適量的裂解液，冰上裂解30 min，離心棄去上清液，加入上樣緩沖液后高溫使蛋白變性，提取各組細胞總蛋白，根據BCA試劑盒說明書計算蛋白濃度，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉后分別與特異性一抗、二抗孵育，用化學發光法進行曝光，用Image J軟件分析目的蛋白灰度值，分析CD40、p-p65蛋白水平。

2.10 統計學方法 所得數據運用Graph Pad Prism 8軟件分析處理，兩組均數比較采用t檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 Pae對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成的影響 與空白組比較，模型組小鼠主動脈及主動脈弓處陽性區斑塊面積顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，Pae中、高劑量組小鼠主動脈及主動脈弓處陽性區斑塊面積顯著減少(P<0.05)。見圖1。

注：A.空白組；B.模型組；C.Pae中劑量組；D.Pae高劑量組；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.2 Pae對AS小鼠主動脈CD36、CD40蛋白共定位的影響 與空白組比較，模型組小鼠主動脈泡沫細胞共定位系數增大(P<0.05)；與模型組比較，Pae中、高劑量組小鼠主動脈泡沫細胞共定位系數顯著減小(P<0.05)，說明Pae顯著下調主動脈泡沫細胞上CD40蛋白表達水平。見圖2、圖3。

圖2 CD36、CD40表達的免疫熒光圖(免疫熒光染色法，10×20倍)

注：A.空白組；B.模型組；C.Pae中劑量組；D.Pae高劑量組；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.3 Pae對ApoE-/-小鼠主動脈miR-145表達水平的影響 與空白組比較，模型組小鼠主動脈miR-145表達水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，Pae中、高劑量組小鼠主動脈miR-145表達水平明顯升高(P<0.05)，說明Pae可以上調AS主動脈miR-145表達水平。見圖4。

圖4 Pae對ApoE-/-小鼠主動脈miR-145表達的影響

3.4 Pae對ApoE-/-小鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平的影響 與空白組比較，模型組小鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，Pae中、高劑量組小鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平顯著降低(P<0.05)，說明Pae能降低AS小鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平。見圖5。

圖5 Pae對ApoE-/-小鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平的影響

3.5 ox-LDL對巨噬細胞活力及脂質蓄積的影響 與空白組比較，ox-LDL 80、160 mg/L時細胞活力顯著下降(P<0.05)，本實驗以80 mg/L ox-LDL開展后續實驗。顯微鏡下油紅O染色顯示：經過ox-LDL(80 mg/L)干預24 h后的巨噬細胞，在油紅O染色中細胞內有紅色脂滴，表明巨噬細胞源性泡沫細胞建立成功。見圖6。

注：A.空白組；B.10 mg/L ox-LDL組；C.20 mg/L ox-LDL組；D.40 mg/L ox-LDL組；E.80 mg/L ox-LDL組；F.160 mg/L ox-LDL組；與空白組比較，*P<0.05

3.6 Pae對巨噬源性泡沫細胞的保護作用 與空白組比較，模型組(ox-LDL 80 mg/L)細胞的活力顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，Pae(15、30、60、120、240 μmol/L)對細胞有不同程度的保護作用(P<0.05)，且在60 μmol/L對ox-LDL損傷的巨噬細胞保護作用最好，故后續實驗采用此濃度。見圖7。

注：A.空白組；B.模型組；C.15 μmol/L Pae組；D.30 μmol/L Pae組；E.60 μmol/L Pae組；F.120 μmol/L Pae組；G.240 μmol/L Pae組；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.7 Pae對巨噬細胞源性泡沫細胞表達miR-145的影響 與空白組比較，模型組miR-145水平顯著下調(P<0.05)；與模型組比較，Pae組miR-145水平顯著上調(P<0.05)，表明Pae可以上調泡沫細胞表達miR-145水平。見圖8。

圖8 Pae對巨噬細胞源性泡沫細胞表達miR-145的影響

3.8 Pae對轉染后巨噬細胞源性泡沫細胞表達CD40、p-p65蛋白的影響 與空白組比較，模型組CD40、p-p65蛋白表達水平顯著上調(P<0.05)；與模型組比較，Pae組CD40、p-p65蛋白表達水平顯著下調(P<0.05)；與Pae組比較，Pae+miR-145模擬劑組CD40、p-p65蛋白表達水平顯著下調(P<0.05)。結果提示Pae通過上調miR-145水平抑制泡沫細胞CD40、p-p65蛋白的表達。見圖9。

注：A.空白組；B.模型組；C.Pae組；D.ox-LDL+Pae組；E.ox-LDL+Pae+miR-145抑制劑組；F.ox-LDL+miR-145模擬制組；G.ox-LDL+Pae+miR-145模擬劑組；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與Pae組比較，△P<0.05

3.9 Pae對轉染后巨噬細胞源性泡沫細胞TNF-α、IL-1、IL-6水平的影響 與空白組比較，模型組TNF-α、IL-1、IL-6水平顯著上調(P<0.05)；與模型組比較，Pae組TNF-α、IL-1、IL-6水平顯著下調(P<0.05)；與Pae組比較，Pae+miR-145模擬劑組TNF-α、IL-1、IL-6水平顯著下調(P<0.05)。結果提示Pae通過上調miR-145水平抑制泡沫細胞分泌IL-1、IL-6、TNF-α的表達。見圖10。

注：A.空白組；B.模型組；C.Pae組；D.ox-LDL+Pae+miR-145模擬劑組；E.ox-LDL+Pae+miR-145抑制劑組；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與Pae組比較，△P<0.05

4 討論

AS不僅是一種脂質代謝紊亂引起的代謝性疾病[8]，而且還是一種慢性血管炎癥性疾病，當機體處于病理狀態時，體內炎癥因子和黏附分子增加，單核細胞在各種因子的驅動下，通過受體介導的方式遷移出血管進入各組織器官，分化為巨噬細胞[9]。巨噬細胞通過表面清道夫受體CD36吞噬ox-LDL，轉化為泡沫細胞[10]，形成早期的AS斑塊，且泡沫細胞分泌的炎癥因子和趨化因子促進炎癥細胞的黏附、浸潤以及細胞外基質的降解，最終導致斑塊的破裂。斑塊破裂又是導致心腦血管突發意外的重要原因[11]。有研究[12]表明，CD36-/-小鼠巨噬細胞吞噬ox-LDL的能力下降，以至于泡沫細胞形成減少，從而導致由泡沫細胞引起的炎癥反應減小，延緩AS的進展。

AS炎癥的發生與多種miRNA有關，miR-145在多種細胞中表達，這其中包括巨噬細胞，miR-145的表達水平可以用來預測心血管疾病患者冠狀動脈病變的存在及嚴重程度[13]。本研究結果表明，AS小鼠主動脈miR-145水平降低，炎癥因子升高，而給予Pae后，miR-145升高，炎癥因子降低；進一步研究miR-145模擬劑、miR-145抑制劑轉染泡沫細胞后miR-145與各種炎癥因子表達變化的關系后發現，轉染miR-145模擬劑后，miR-145表達上調，炎癥因子水平下降，轉染miR-145抑制劑后，miR-145表達下調，炎癥因子水平上升。因此Pae抑制炎癥的作用可能與上調miR-145的表達有關。

CD40是miR-145的靶基因，受miR-145的調控[14]。在生理情況下，巨噬細胞源性泡沫細胞膜蛋白CD40是低表達或不表達的，當遇到炎癥等刺激時其表達量上調，CD40受體與其配體結合后，激活CD40受體，導致NF-κB活化易位，誘導炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α的分泌[15]。本研究轉染miR-145模擬劑泡沫細胞后結果顯示，CD40蛋白及其下游p-p65蛋白表達水平顯著下調，與Pae干預后miR-145表達水平上調、CD40蛋白及其下游p-p65蛋白表達水平顯著下調結果一致。轉染miR-145抑制劑后，Pae具有逆轉miR-145表達下調，CD40蛋白、p-p65蛋白表達上調的作用。因此，Pae可能通過上調miR-145的表達抑制CD40蛋白及其下游p-p65蛋白的表達，抑制炎癥因子的分泌，減輕泡沫細胞炎癥反應。

本研究結果表明，Pae對巨噬細胞源性泡沫細胞分泌的炎癥因子具有顯著的抑制作用，該抑制作用可能與Pae上調miR-145的表達從而抑制炎癥通路CD40/NF-κB有關，該研究結果為Pae抗AS作用的分子機制提供了實驗證據。