基于金納米結構的光譜探針在傳感器中的應用*

李紫瀅，楊 夢，陳志雄，劉嘉麗，管 燕,胡 蓉,楊 通，楊云慧

(云南師范大學化學化工學院，云南 昆明 650500)

納米結構是指在維度上至少有一個維度處于納米級(1～100 nm)，或者是以納米級的材料作為基本單元而存在的材料，金納米結構基于其獨特的性質被認為是生物醫學應用的最佳選擇。常見的金納米結構有金納米簇[1]、金納米球[2]、金納米棒[3]、金納米線[4]、金納米雙錐[5]、金納米片[6]、金納米籠、金納米立方體[7]、金納米星[8]和金納米花等。在分析化學領域，金納米結構由于其較小的尺寸、良好的生物相容性和獨特的光學性質，可作為優良的光學探針應用于生化傳感和光學成像[9]等領域。其中局域表面等離子共振性質(localized surface plasmon resonance, LSPR)是金納米結構重要的光學性質之一，當一定頻率的光照射到尺寸遠小于光的波長的金屬納米粒子表面時，如果入射光子頻率與金屬納米粒子的表面傳導電子產生的集體振蕩頻率相同，電子和光子在金屬納米粒子的表面的局部區域發生劇烈的共振，此現象稱為LSPR性質。金屬納米粒子的LSPR性質與它自身元素成分以及形狀、尺寸大小還有外界的介質微環境等因素有很大的關系。由于金納米結構在可見或近紅外區域有明顯的LSPR峰，可用比色分析法來對目標物進行定量或者定性分析。目前，基于納米結構的可視化分析策略主要集中在以下幾個方面：(1)當金納米結構處于小尺寸時，約在2 nm以內，其以納米簇的形式存在，不具有明顯的吸收特性，但金納米簇都具有熒光性質。目前基于金納米簇的光學分析以熒光分析為主，通過熒光猝滅的作用也可實現對靶物的可視化分析檢測，例如：Yang等合成了一種賴氨酸穩定的金納米簇和牛血清蛋白穩定的金納米簇的混合溶液用于Cu2+的高靈敏檢測，當Cu2+存在時，熒光很容易被猝滅[10]。(2)金納米球狀顆粒的團聚使得溶液顏色由紅色變為藍色，即金納米結構間的距離比平均粒徑大時，金納米結構就處于分散的狀態，此時溶液為紅色；當分析物存在時，導致金納米結構間的間距小于平均粒徑時，金納米則處于聚集狀態，溶液呈現藍色[11]。(3)針對于金納米棒和金納米雙錐等納米結構，因具有縱向和橫向等離子體吸收的光學特性，可以通過腐蝕或者Ag+沉積的方式誘導其膠體溶液顏色發生改變，實現對分析物的可視化檢測[12]，比如在金納米結構表面沉積Ag，會導致其LSPR峰發生藍移?；谠撛韺δ繕宋锏谋壬治隹梢栽谝欢ǔ潭壬媳苊饨鸺{米結構的自團聚造成的“假陽性”的結果。(4)由于金納米結構獨特的散射特性與材料本身以及周圍介質環境有密切的關系，因此，可以利用暗場散射分析法對目標物進行定性和定量的檢測分析。相比于前面的比色法，暗場散射分析法可以在單個納米粒子水平對目標進行檢測分析。

基于以上的性質，金納米結構在化學和生物傳感方面得到了廣泛的應用，本文綜述了金納米結構作為光學探針在生物和化學傳感方面的應用，主要介紹了金納米結構在重金屬離子、食品有毒物質、腫瘤標志物、生物毒素以及核酸檢測等方面的應用，并對金納米結構未來的發展前景進行了展望。

1 在化學傳感中的應用

1.1 重離子的檢測

Hg2+可通過食物鏈在人體重要器官中積累，可引起腦損傷、腎功能衰竭等慢性疾病。對水和食品資源中的Hg2+進行高選擇性、靈敏、廉價、簡便的監測對環境保護和食品安全至關重要。Zohora等[13]利用肉桂葉提取物合成具有可控光學性質的金納米顆粒對汞離子進行快速比色檢測。Miyake等報道Hg2+可以與DNA的兩個胸腺嘧啶(T)相互作用，形成穩定的T-Hg2+-T，具有高度選擇性，這種基于DNA結構的傳感器能夠選擇性地檢測水相中的Hg2+。但是這種方法，靈敏度相對較低[14]。為了解決這個問題，2017年，Yu等[15]設計了一種用于Hg2+檢測的比色/熒光雙模生物傳感器，使用熒光染料標記的DNA發夾進行雜交連鎖反應(hybridization chain reaction,HCR)，可以極大地提高檢測的靈敏度。該研究最大的特色是：通過比色法可以用肉眼直接觀測測定結果，而熒光檢測可以在更廣的鹽濃度范圍內進行，對工業廢水的一般環境分析和評價具有良好的潛力。

圖1 超靈敏檢測Hg2+的比色/熒光雙模傳感器的工作原理[15]

1.2 食品中有毒物質的檢測

三聚氰胺是一種富含氮的化學物質，在2008年，中國發生三聚氰胺奶粉事件以后，三聚氰胺越來越受到人們的關注。傳統的檢測方法都需要專業的操作人員且成本較高。因此，需要尋找一種可以快速、簡便、靈敏度高的檢測三聚氰胺方法。Cao等[16]建立了一種檢測三聚氰胺的比色法。通過將相應的金屬陽離子(Au3+)與還原劑3,5-二羥基苯甲酸混合，實現了金納米粒子在水中的一步合成，添加三聚氰胺后，3,5-二羥基苯甲酸與三聚氰胺發生強氫鍵相互作用。因此，金納米顆粒的形成被三聚氰胺打斷。由于沒有足夠的還原劑來還原Au3+離子。當三聚氰胺濃度增加時，溶液顏色會由紫色變成黃綠色。該方法可以對三聚氰胺進行簡單、高效的識別和定量。根據形成的金納米顆粒(Au NPs)的顏色變化，可以直接監測三聚氰胺的濃度。2015年，Yin報道了一種基于H2O2-Au NPs快速靈敏比色法用于檢測牛奶中的三聚氰胺[17]。用過氧化氫快速還原金離子，生成準球形非聚集Au NPs，得到紅色溶液。當有三聚氰胺時，H2O2可以與三聚氰胺反應，生成穩定的化合物。隨著過氧化氫的消耗，Au NPs的生長速度減慢，導致Au NPs聚合形成藍色溶液，其檢測原理見圖2。這種方法的可以檢測低于 20 μM的三聚氰胺，檢測限為0.4 μM。

圖2 基于H2O2-Au NPs快速檢測牛奶中三聚氰胺的示意圖[17]

2017年，Chen等[18]利用海膽型金納米作為探針，實現了簡單、快速、有選擇性的三聚氰胺檢測?；诮鸺{米海膽的聚集，在pH值為5.72時對三聚氰胺進行檢測，這種方法的線性范圍約為0.1～1 μM,檢測限為18 nM。2018年，Hu等[19]提出了一種基于適體修飾的Au NPs的比色方法，這種方法簡單、選擇性好、靈敏度高，適用于微量樣品中三聚氰胺的檢測。

2 在生物傳感中的應用

2.1 腫瘤標志物的檢測

人甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)已被廣泛認為是一種診斷性生物標志物，可用于檢測早期的人類肝細胞癌。2016年，Ma等[20]基于金納米探針，檢測AFP濃度。首先在微孔板上固定AFP抗體和AFP抗原以及過氧化氫酶標記的AFP抗體形成三明治型的免疫復合物，然后過氧化氫酶作為催化劑催化H2O2分解為H2O和O2，最后，通過Fe2+離子作為催化劑使H2O2歧化生成更活潑的自由基(·OH)。·OH與金納米棒(Gold Nanorods, Au NRs)進行定量反應，·OH可作為氧化劑將Au(0)氧化為Au(III)，溶液顏色的變化覆蓋了從400～ 760 nm的可見光范圍，可以很容易地用肉眼分辨出來。溶液的最終顏色與靶蛋白的濃度密切相關。這種方法的檢測范圍為0～120 ng/mL，LOD為5.0 ng/mL。2017年，Ma等[21]首次將貴金屬納米顆粒的散射光用于同時檢測雙重腫瘤生物標志物，在三明治免疫分析的基礎上，用兩種雙散射光色的納米探針同時檢測甲胎蛋白和癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen, CEA)。該方法檢測甲胎蛋白和癌胚抗原具有靈敏度高，選擇性好的優點，但是線性范圍較窄。2020年Jiang等[22]開發了一種基于Au@Ag@SiO2的酶聯免疫吸附測定系統，通過雙輪信號放大策略對前列腺特異性抗原(prostate specific antigen, PSA)進行比色/聚合酶鏈反應/熒光檢測。Cheng等[23]報道了一種基于兩種無酶等溫核酸擴增方法：雜交鏈式反應(hybridization chain reaction, HCR)和催化發夾組裝(catalyzed hairpin assembly, CHA)的DNA等離子體分析，該方法可通過肉眼檢測到超低濃度的PSA。

圖3 NEQ-ELISA檢測人甲胎蛋白(AFP)的示意圖(a)[20]；在DFM下同時測定AFP和CEA的示意圖(b)[21]

外泌體是由活細胞分泌到細胞外環境中的納米級膜囊泡，廣泛存在于各種體液中。因為外泌體攜帶的多種蛋白質反映了親代細胞的起源，成了癌癥診斷的新興生物標志物。2017年，Jiang等[24]報道了一種基于適體和Au NPs的簡單比色方法來檢測外泌體上的蛋白質。2020年，Zhang等開發了一種靈敏且易于操作的基于金納米雙錐(Au nanobipyramids, Au NBPs)的等離子體比色策略。這種等離子體比色法靈敏度高、顏色變化豐富。這種方法由兩部分組成。在第一部分，外泌體引發競爭性反應，在此過程中，通過設計多個占位鏈產生大量堿性磷酸酶(ALPs)，有效地簡化了過程并放大了信號。在第二部分中Au NBP@MnO2納米片的刻蝕引起Au NBP@MnO2納米片的形態變化導致金納米粒子的LSPR帶藍移。因此，可以通過這種方法簡單而靈敏地定量外泌體，此外，此方法還可以通過改變捕獲序列擴展到檢測其他生物分子[25]。

圖4 通過Au NBP@MnO2NSs的競爭反應和蝕刻進行外泌體比色檢測的原理圖[25]

2.2 生物毒素的檢測

赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)是由多種生長在農作物上的曲霉和青霉產生，它穩定性強，難以降解，這種毒素會引起腎臟損傷。Soh等[26]在Au NPs表面修飾OTA的適體，當有OTA存在時，OTA會與適體特異性結合，適體遠離Au NPs，向體系中加入羥胺(NH2OH)會將HAuCl4還原成金單質在原始的金種上均勻地生長，此時觀察到溶液顏色為紅色;若體系中沒有OTA存在時，有適體包裹的金納米顆粒不均勻生長，溶液的顏色為藍色。通過肉眼便能實現OTA的可視化分析檢測，檢出限為1 nmol/L。

圖5 可視化檢測OTA的示意圖[26]

微囊藻毒素(Microcystins, MCs)是最廣泛存在的藍藻毒素，具有多種毒性作用，可導致免疫系統、泌尿系統、消化系統或生殖系統的損傷。2018年，Wei提出一種基于CdS/ZnO空心納米棒陣列的光電流變化和Au NBPs@Ag表面等離子體共振峰的藍移，構建了一種雙模分裂型免疫傳感器來檢測微囊藻毒素-LR(MC-LR)。這種方法檢測的線性范圍為0.05～5 μg/L，對于PEC檢測，檢測下限為0.03 ng/L，而比色檢測的檢測下限為0.04 ng/L。該方法具有雙模態信號讀出的獨特優點，實現了更靈敏、可靠的分析[27]。

圖6 雙模分裂型免疫傳感器來檢測微囊藻毒素-LR的示意圖[27]

2.3 核酸的檢測

MicroRNAs (miRNAs)是一種長度為19～23個核苷酸的短非編碼分子，在基因表達、細胞周期、生物學發育等方面發揮著重要作用。然而，由于miRNA在血漿或血清中的序列短、序列相似度高、豐度極低(人血清中<1.0 pM)，因此miRNA的測定具有挑戰性。由于金納米粒子表面易于被修飾，在金納米粒子與核酸分子結合后其顏色會發生明顯的變化，我們可以利用這一性質對核酸分子進行檢測。2017年，Gu等[28]開發了一種基于催化發夾自組裝 (cascades of catalyzed hairpin assembly, CHA) 和雜交鏈反應 (hybridization chain reaction, HCR)擴增技術和Au@Ag納米探針蝕刻的高靈敏度miRNA-141檢測方法。這種方法對miRNA-141具有超高的敏感性，動態范圍為5.0×10-17～1.0×10-11M。2019年，Zhao等[29]提出了一種基于等離子體Au@Ag “nanosnowman”形成的對miRNA高度敏感和選擇性檢測的新方法。由miRNA-21觸發的雙金屬納米粒子具有不對稱的Au@Ag頭-體結構，局域表面等離子體共振(LSPR)散射波長發生明顯的紅移，顏色由綠色變為紅色。結合HCR擴增策略，該測定方法對1 fM～100 pM的miRNA-21具有良好的選擇性，在暗場顯微鏡下具有極高的靈敏度，檢測限為0.60 fM。Cai等[30]開發了一種簡單且低成本的比色分析方法，使用與RNA結合的寡核苷酸作為傳感探針來定量檢測miRNA-148a的濃度。寡核苷酸與Au NPs通過Au-S鍵結合，通過結合的球核酸探針和目標RNA之間的夾心雜交反應控制Au NPs分布狀態(分散/聚集)。

圖7 基于CHA-HCR擴增技術和Au@Ag

3 結 語

近年來，利用金納米結構獨特的光學特性，已經開發了一系列基于金納米結構為光學探針的化學和生物傳感器。這些傳感器在檢測重金屬離子、食品有毒物質、蛋白質、生物毒素、核酸以及生物小分子方面得到了廣泛的應用，具有高靈敏度和高選擇性，可以簡單快速的檢測目標物(見表1)。但是將這類方法用于實際檢測中，還需要做出更多的努力：(1)在合成及納米結構方面，合適的形貌和尺寸直接影響后續樣品中目標靶物的準確定量分析。(2)現有的基于金納米結構的光學分析方法靈敏度相對較低，以后的工作可以借助循環信號放大的策略進一步提高對目標物的分析靈敏度。(3)在生物檢測方面，含有生物巰基化合物容易通過Au-S鍵與金納米結構結合從而干擾生物分子分析的準確度，從而造成檢測過程中“假陽”或“假陰”信號，帶來不必要的麻煩，因此，開發捕獲探針與金納米結構更多的連接方式也是非常有必要的，如近些年來，山東師范大學唐波老師課題組開發的Au-Se鍵的結構方式，就有利于排除生物巰基化合物在生物成像中的干擾，因為Au-Se鍵的結合方式比Au-S鍵更穩定，從而提高了金納米結構在生化分析中的抗干擾能力[34]?；谏鲜鰡栴}，研究者可以繼續探索新的策略和方法來優化現有的合成方法以及金納米結構的功能化方法以提高金納米結構的穩定性。在金納米結構表面修飾特定配體如抗體、核酸和肽等，來提高對目標分析物的選擇性等。

表1 金納米結構在化學和生物傳感中的應用