等離激元增強熒光的納米結構、機制及其應用*

鐘 婷，鄢 強，盧 茜，王 盼，孫豐云，陳佳琪，2

(1 成都大學 機械工程學院，四川 成都 610106；2 四川省粉末冶金工程技術研究中心，四川 成都 610106)

熒光是指熒光物質的基態電子受到某種特定波長的激發光照射時躍遷到激發態，在回到基態過程中釋放光子的現象。相比之下，PNP在單色電磁輻射激發下顯示出極弱的光致發光，然而等離激元納米結構的光學消光(吸收+散射)截面比分子熒光物質的光學消光截面高幾個數量級[1]。原因是等離激元納米結構產生的局域表面等離激元共振效應[2]，使得等離激元的消光截面顯著增強。等離激元增強的熒光光譜是一種非常出色的光學檢測手段，具有超高靈敏度，熒光物質與等離激元的共振耦合可以大大提高發射強度、角分布、輻射偏振以及輻射衰減速度[3]。通過對等離激元納米材料的優化，熒光增強因子(EF)最多可以提高三個數量級，EF>103[4]。

最近幾年，等離激元熒光增強的實驗和理論研究取得了爆炸性的進展，并且也有了一系列新的發展和應用。例如，等離激元納米結構的熒光增強提高了單分子熒光和成像分辨率的靈敏度[5]，并將單分子檢測研究擴展到弱發射物的檢測。等離激元增強熒光的納米材料因在提高相應器件或工藝的性能以及在光學性能方面展現出獨特優勢，被廣泛應用于生物傳感器[6]、生物成像[7]、生物醫學診斷[8]等生物醫學方面，對光熱治療、光學治療和生物成像多功能一體化具有重要意義，同時等離激元熒光增強技術在催化劑、太陽能電池和新能源等領域都具有重要的促進作用。本文綜述了等離激元熒光增強機制、構效關系及其在生物方面的應用，并對各領域可能存在的潛在應用進行了展望。

1 等離激元增強熒光的機制

在光譜學中，最常見的熒光物質是有機染料分子，其特征是具有芳香環或共軛碳鏈。熒光物質受到特定的激發光照射并吸收高能光輻射后，導致內部電子能級躍遷，由現處于的軌道躍遷到能量更高的軌道，通常是從基態激發到激發態，由于激發態不夠穩定，因此會以特定的躍遷方式返回到基態，并重新釋放低能長波光，即產生熒光。然而分子熒光的消光系數較低且其光穩定性差，在激發之后，可能會參與某些化學反應，導致分子熒光存在幾乎不可逆轉的損失，而降低激發功率會產生較弱的熒光發射，限制光漂白效應，從而延遲信號衰減。PNP表面的自由電子在外部電磁場的驅動下，偏離原子核產生一種光激發的集體震蕩，被稱為局域等離激元共振(LSPR)。由于PNP具有優異的LSPR性質，其附近的電磁場可得到極大增強，在納米尺度上具有指數級的空間變化。等離激元增強熒光現象出現在熒光物質靠近PNP時，熒光物質的發光強度較其自由狀態下明顯增強。通過等離激元增強熒光的新穎方法，可對熒光信號進行放大，同時增加熒光物質的亮度及其光穩定性。因此，等離激元增強熒光的原理是(如圖1所示)，LSPR導致的局域電磁場增強效應可有效地改變熒光物質所處的介電環境，從而對熒光物質的激發和發射過程進行調制，通過提高其激發和輻射效率以達到熒光增強的目的。影響LSPR的因素通常包括PNP的元素組成、形狀、尺寸、顆粒間距和環境介質等。因此，通過研究PNP本身的特征(如納米核的材料、形狀和尺寸等)，熒光物質與納米核的距離，以及LSPR與熒光物質吸收和發射光譜的重疊程度對熒光增強的影響，可優化等離激元納米結構以達到最佳的熒光增強效果。

圖1 等離激元納米結構增強熒光過程示意圖

2 PEFNSs的構效關系

隨著納米顆粒合成的發展，具有不同形貌的PNP被設計并用作等離激元熒光增強的納米核，從而增強了其附近染料分子的熒光強度。PEFNSs由PNP核心以及表面包覆的殼層組成，核與殼通過物理或化學作用相互連接。通常地，在具有某種形貌特征的PNP表面包覆介孔材料(如介孔二氧化硅，SiO2)，得到PNP@SiO2的核殼納米結構。包覆介孔殼的PNP又通過化學和物理吸附等方式促進熒光染料吸附到其表面，形成PNP@SiO2+Dye納米結構(如圖2所示)。研究表明，此類核殼納米結構的等離激元熒光增強效應受納米顆粒的組份、尺寸、形狀和熒光物質與PNP之間的間隔距離、熒光物質與等離激元吸收帶之間的光譜重疊程度的影響。

圖2 染料與等離激元核殼納米顆粒結合的方案

2.1 等離激元納米核材料、形狀和尺寸對熒光增強的影響

PNP的材料、形狀和尺寸對等離激元熒光增強有很大的影響，通過優化PNP的特征可以使EF得到極大地提升。等離激元納米材料種類的選擇主要取決于PNP的LSPR峰位調節能力、消光強度以及化學穩定等特性，如金、銀納米顆粒的LSPR峰位從可見到紅外區豐富可調，通常可用于增強可見-近紅外光區的熒光。金納米顆粒具有良好的穩定性、化學惰性和生物相容性，且易與生物分子相互作用。而銀納米顆粒具有狹窄的共振吸收帶和較高的散射效率，獲得的熒光強度增強倍數較金納米顆粒略強。Sorenson等[9]在金膜上面沉積銀納米膠體，發現與單一的銀納米膠體相比，平均增強了50倍，Luchowski等[10]在半透明的銀膜上組裝銀納米膠體，獲得了進一步提升，平均增強了70倍。

此外，采用種子介導的方法可以準確地調控金納米顆粒的大小和形狀[11]，可在溶液中生長出不同尺寸的金納米球(GNSs)、金納米棒(GNRs)、金納米棱鏡(GNPRs)等。通過對PNP形狀的調控可以對LSPR峰強和峰位特性進行調制，從而影響其熒光增強效應。李志遠等[12]通過比較具有相同殼層的GNRs和GNSs研究了形狀對熒光增強的影響。發現與GNSs相比，GNRs尖端的電磁場更大，同時GNRs的雙等離激元共振同時對熒光的激發和發射過程具有增強效果(見圖2(a)、(b))。歐陽金等[13]研制了一種新的基于GNPR的熒光探針——GNPR@SiO2@二氫卟吩Ce6(Ce6)，通過與對照組GNR@SiO2@Ce6進行等離激元增強熒光比較，結果發現，GNR@SiO2@Ce6的熒光增強倍數小于GNPR@SiO2@Ce6，說明GNPR比GNR具有更好的等離激元增強熒光效果。

最后，通過改變PNP的尺寸也可得到優化的熒光增強效果。Li的團隊[14]制備了尺寸在50～300 nm之間的銀納米顆粒，其可見吸收峰隨著納米顆粒尺寸的增大而紅移，表明銀納米顆粒的表面等離激元共振特性也隨尺寸可調。Aroca組[15]通過改變金納米顆粒的大小，發現與核尺寸為4 nm的小金納米顆粒(EF≈25)相比，核尺寸為100 nm的大金納米顆粒產生更高的EF(約60)。

2.2 等離激元納米核與熒光物質間距對熒光增強的影響

在PEFNSs中，EF和等離激元納米核與熒光物質間的距離密切相關。高媛媛組[16]制備了不同厚度(分為7 nm、12 nm、18 nm、20 nm和24 nm)的GNR@SiO2，且采用靜電吸附方法與碳量子點結合，并測定熒光光譜如圖2(c)所示，不同殼層厚度的GNR@SiO2對碳量子點的熒光增強倍數分別為8.9、10.8、17、25.3和15.9倍。杜學忠組[17]在研究Ag@SiO2納米結構時，發現由于無定形SiO2中光程的增加和激光焦點與銀核的偏離，當Ag@SiO2納米顆粒的厚度為9 nm時，熒光強度最高。此外，朱一華等[18]通過調節Ag@SiO2納米結構的殼層厚度控制銀納米顆粒與碳量子點之間的距離，發現當銀納米顆粒與碳量子點的距離是(10±2) nm時，碳量子點的熒光發生猝滅現象；而當距離為(20±2) nm時，碳量子點熒光強度增大了4倍；并且發現間距變為(30±2) nm時，熒光強度開始下降。與此同時，Jérémie等[19]通過改變Ag@SiO2納米材料與熒光素5(6)-異硫氰酸酯的距離，從而獲得了該核殼納米顆粒的熒光衰減曲線[19]。其結果顯示當熒光物質位于離PNP表面10～15 nm之間觀察到熒光的最大增強，而在離核心5 nm或更小的地方猝滅現象占優勢。研究均表明，通過改變PNP-熒光物質的距離，等離激元增強熒光的核殼納米結構的EF隨介孔殼厚度的增加呈現先增加后降低的趨勢。通常當距離在10～20 nm時，增強能力最強[20]。這是因為當熒光物質與PNP的距離相近時，由于非輻射能量轉移到PNP，導致熒光發生明顯猝滅[21]。隨著熒光物質逐漸遠離等離激元納米核心，阻止了熒光猝滅的發生，PNP表面的熒光物質逐漸由熒光猝滅狀態變為熒光增強狀態。隨著其厚度進一步增加，PNP的局域電磁場傳遞到熒光分子的機率減少，從而導致整個體系的熒光強度的衰減。因此，在等離激元增強熒光的核殼納米結構體系中，可通過調整PNP與熒光物質間距以達到最佳的熒光增強效果。

2.3 熒光物質種類對熒光增強的影響

影響熒光增強的因素除了等離激元納米結構本身以外，其加入的熒光物質種類也會對熒光增強因子和量子產率造成影響。Gartia等[22]研究了五種不同熒光染料在直徑為80 nm的銀納米襯底表面的熒光增強因子和量子產率。選擇了五種不同量子產率范圍和不同激發波長范圍的染料，分別為羅丹明6G(R6G， λex=532 nm)、熒光黃(λex=440 nm)、吖啶橙(λex=440 nm)、羅丹明-B(Rh-B，λex=532 nm)、曙紅-Y(λex=532 nm)。結果發現，與玻璃表面相比，等離激元Ag納米襯底上的R6G、熒光黃、吖啶橙、羅丹明-B和曙紅-Y的熒光分別增強了20.5、100、8.34、5.13和4.3倍，并且五種熒光染料在PNP表面的量子產率分別為99%、99%、75%、86%和85%。此外，通過量子產率和熒光壽命測試，發現所有染料的輻射衰變率和非輻射衰變率之比都大于1。等離激元納米結構熒光增強還依賴于熒光物質種類的激發、發射光譜與納米顆粒的LSPR峰位的匹配程度。Asselin等[23]分別將Ag@SiO2與不同的熒光物質(熒光黃、曙紅和Rh-B)作用，發現等離激元帶(460 nm左右)與熒光物質種類激發帶的重疊明顯相關：5 nm間隔物的EF值從10.9(異硫氰酸熒光素，FiTC)降低到4.9(曙紅異硫氰酸酯，EiTC)到3.5(羅丹明B異硫氰酸酯，RBiTC)(如圖2d所示)。同時該實驗也表明對于具有足夠重疊的所有熒光物質種類，最大EF的最佳距離是相同的。由此可得出，熒光增強高度依賴于熒光物質激發-發射能級與等離激元共振帶的重疊程度，匹配程度越高，熒光增強的作用就越明顯。

圖3 等離激元增強熒光的納米結構的構效關系

3 應 用

PEFNSs具有優異可控的光學性質，較強的生物相容性和表面可修飾性等優點，對在生物醫學領域的廣泛應用具有重要意義。利用等離激元納米結構表面熒光探針增強的熒光信號，可實現生物物質的靈敏檢測；PNP可實現多功能和靶向修飾，與熒光物質結合在生物成像方面也有良好的應用；因PEFNSs與上轉換發光材料結合，激發光具有較強的組織穿透力和較低的輻射損傷，故在腫瘤的光學療法中也得到了非常重要的應用。此外，PEFNSs在催化、生物監測和化學物質檢測等方面也有一定的應用前景。

圖4 等離激元增強熒光的納米材料在生物傳感器[24],生物成像[7],腫瘤治療[25],催化劑[26]等方面的應用

3.1 生物醫學應用

3.1.1 生物傳感器

生物傳感器是檢測低濃度生物標志物的一種途徑[24]。熒光生物傳感器是最受歡迎的生物傳感技術之一，通過將等離激元納米結構和熒光物質放置在非常接近的位置，可以顯著增強生物熒光物質信號強度。Kim小組[25]使用新型的水凝膠微陣列制造了一種基于酶的熒光生物傳感器用來檢測對氧磷(一種著名的神經毒性有機磷化合物)，該微陣列使用了帶有量子點的 Ag@SiO2核殼納米結構，利用等離激元增強的熒光來放大熒光信號。通過調節SiO2的厚度優化了Ag@SiO2的熒光增強效果，其熒光強度比沒有量子點的核殼納米結構提高了5倍，檢測限約為0.1 nM。2014年，Wang等[26]制備的Ag@SiO2-DNA-Cy3納米生物傳感平臺，被應用于金屬離子和有機小分子檢測。這項工作中，DNA雜交是在目標分子存在地情況下進行的，通過與DNA單鏈雜化將Cy3熒光物質帶到納米結構表面，Cy3的熒光強度可以通過Ag納米顆粒表面的LSPR來增強。這種生物傳感器為Hg2+的檢測提供了高靈敏度和選擇性，檢測限值為1.4 nM，該生物傳感器可被開發用于其他金屬離子和有機分子分析。大多等離激元增強熒光生物傳感器的工作都集中在平面結構附近的熒光物質上，而基于溶液的靈敏生物傳感器的研究非常有限。2014年，龐元峰等[27]使用Ag@SiO2納米顆粒靈敏地檢測H5N1流感病毒地重組血凝素蛋白(rHA)。將抗rHA適配子固定在PNPs的表面，并使用噻唑橙熒光標記作為等離激元增強熒光平臺，這一檢測過程只需要30 min，檢測限為 2 ng·mL-1。等離激元增強熒光的納米材料提高了檢測靈敏度并縮短了分析時間，在生物傳感器設計中具有極大的應用潛力。

3.1.2 生物成像

生物成像技術通過應用“成像”技術來促進疾病的診斷、治療和預防，在改善人類健康方面發揮了至關重要的作用[28]。陳海燕等[29]通過金納米簇(GNC)與腫瘤組織表面高表達αvβ3整合素的環狀RGD(cRGD)和對核蛋白具有高親和力的適體AS1411(Apt)結合，初步建立了具有雙重靶向功能的新型納米平臺，即GNC-cRGD-Apt，用近紅外熒光染料(MPA)進一步功能化GNC-cRGD-Apt，得到近紅外熒光雙靶向探針GNC-MPA-cRGD-Apt。通過直接觀察GNC-MPA-cRGD-Apt在腫瘤小鼠模型中的生物分布準確確定腫瘤部位，且GNC-MPA-cRGD-Apt是通過腎-膀胱排泄系統排出。為了驗證GNC-MPA-cRGD-Apt探針的體力內結果，分別在1 h、4 h、8 h和24 h處死小鼠，收集主要臟器并進行成像，實驗結果表明，腎臟各時間點均出現較強的熒光信號，注射后24 h，除腎臟出現中度熒光信號外，其余主要組織的熒光均消失。體外顯像結果與體內顯像結果一致，其中熒光在注射后6 h出現，在注射后8 h完全消失。為了進一步證實GNC-MPA-cRGD-Apt的腫瘤靶向性，用激光共聚焦顯微鏡觀察了探針的體外腫瘤分布，結果發現在腫瘤的表面和深處都觀察到了更強的綠色熒光。以上實驗結果在體內外均表現出低的細胞毒性和良好的腫瘤靶向能力，表明其在腫瘤成像方面的臨床潛力。楊飄萍等[30]利用GNR@GdOF：Yb3+，Er3+上轉換納米棒(UCNRs)來檢測其體內紅外熱成像效應，在注射了100 μL生理鹽水、GNRs(1 mg/mL)和UCNRs (1 mg/mL)后，用980 nm激光照射荷瘤小鼠，發現UCNRs組溫度隨時間增加而升高(從36.0 ℃升至50.9 ℃)，明顯高于生理鹽水組和GNRs組，具有良好的體外光熱成像。以等離激元為介導的熒光為納米尺度的成像提供了先進的場景，并正在成為生物科學中的主要光譜工具。

3.1.3 光熱、光動力治療(增強上轉發光)

近年來利用納米材料進行光熱治療(PTT)、光動力療法(PDT)得到了醫學領域研究人員的青睞。眾所周知，PTT是一種具有高特異性的癌癥治療方式，在980 nm激發光照射下，利用光熱轉換產生的高熱量在不損害其它正常組織的情況下，實現病變細胞的靶向治療[31]。陳曉蘭等[19]開發了一種摻雜了熒光染料RBiTC和細胞穿透肽(R8)的新型多功能二氧化硅納米結構——Pd@Ag@SiO2(RBiTC)-R8，該納米結構可增強細胞對納米顆粒的攝取，進一步提高PTT治療效率。實驗通過進行標準MTT比色法測定來評估Pd@Ag@SiO2(RBiTC)-R8的潛在細胞毒性，從24 h后得到的測量平均值看出，在0～ 300 g·mL-1濃度范圍內，細胞存活率估計在80%以上，其低細胞毒性顯示了該納米結構在PTT中的應用潛力。

PDT是利用光激發光敏劑產生活性氧進行癌癥治療的方法。傳統的有機PDT光敏劑(例如：Ce6和ZnPc)存在著易光漂白、穩定性差以及體內循環快的問題，而PDT因其優異的選擇性，良好的適用性，操作流程簡單以及可反復多次治療等優點，被廣泛應用于癌癥的治療。黃文澤等[32]設計了一種用于治療新型癌癥的治療劑，由上轉換納米顆粒(UCNP)和介孔二氧化硅包覆的GNRs與光敏劑部分花青540(MC540)組成的雜化納米系統，UCNP和GNR之間的高光密態可以誘導等離激元增強，從而改善PTT和PDT。治療劑是包埋在納米氣泡(NB)內的GNR@UCNP偶聯物(GNR@UCNP@NB)，808 nm的近紅外光從UCNP傳遞到GNR，從而賦予GNR高溫等離激元效應，此外MC540光敏劑產生活性氧(ROS)，從而激活癌細胞的凋亡途徑。用JC-1染料作為線粒體膜電位的指示劑，以確定細胞死亡的機制，體內外分析結果證實了改良雙光療的療效明顯增強。由此可見，將等離激元納米材料與UCNPs結合更易到達腫瘤部位，且有效提高光敏劑局部濃度的新材料和創新方法可提升PTT與PDT在腫瘤治療中的效用，對腫瘤增強的PTT和PDT多功能一體化具有重要的意義。

4 結 語

(1)等離激元納米材料在某一特定頻率的激發光照射下，表面的傳導電子發生集體振蕩而產生局域的表面等離激元共振。局域等離激元共振導致的局域電磁場增強效應可有效地改變熒光物質所處的介電環境，從而對熒光物質的激發和發射過程進行調制，通過提高其激發和輻射效率達到熒光增強的目的。

(2)納米顆粒的組成、尺寸、形狀、核殼間隔層厚度以及熒光物質和等離激元吸收帶之間的光譜重疊程度等方面都在一定程度上對熒光增強產生影響。PNP熒光增強隨核心尺寸的增加而增加，在一定范圍內，達到最大熒光增強；PNP熒光增強強度隨等離激元納米材料和熒光物質間距先增加后降低；當熒光物質的發射、吸收光譜與等離激元帶的光譜的重疊程度越大時，熒光增強的效果就越明顯。通過對PEFNSs進行調整和優化，可達到最佳熒光增強效果，從而實現特定功能下的應用。

(3)由于具有獨特的光學性質，等離激元增強熒光的納米材料被廣泛應用于生物醫學領域，在生物傳感器、生物檢測、生物成像、醫療診斷等方面都存在巨大的應用潛力。此外，PEFNSs正在滲透到生物、化學和物理甚至工業、制造業等更多的領域。