人工種植燈盞細辛總黃酮的提取工藝研究

王亞倫，楊允輝，朱站站，王天龍，李婧煒

(1 大理大學藥學院，云南 大理 671000；2 云南白藥集團大理藥業(yè)有限責任公司，云南 大理 671000)

燈盞細辛又名燈盞花，為菊科植物短葶飛蓬的全草[1]，主要分布于我國西南部云南、四川、廣西、貴州、西藏等地[2]。燈盞細辛具有散寒解表、祛風除濕、活血化瘀、通經(jīng)活絡、消炎止痛之功效。燈盞細辛中各類成分繁多，如黃酮、植物甾醇、揮發(fā)油、氨基酸及微量元素等[3]。藥理學研究表明，通過浸漬法[4]、超聲提取法[5]、組織破碎提取法[6]、堿水提取法[7]、回流提取法[8]等各種方法，從其中提取出的黃酮類化合物具有擴張腦血管、冠脈血管，改善微循[9-10]，抑制血小板凝集、抗凝血、抗心肌梗死[11]，防止腦缺氧及腎功能衰竭等多種藥理作用[12-13]。燈盞細辛中黃酮類化合物是其主要成分，具有廣泛的開發(fā)前景和利用價值，值得綜合利用和加強資源開發(fā)[14]。

自燈盞細辛被研發(fā)成為藥品后，其野生資源被大量采摘。一方面，客觀的經(jīng)濟效益驅使著農(nóng)戶上山過度采摘，采挖時通常連根拔起，燈盞細辛的資源環(huán)境同時也遭到嚴重破壞，野生資源儲備逐年遞減。另一方面，收購價格不斷上漲，企業(yè)生產(chǎn)成本增加。資源面臨著枯竭，這勢必影響燈盞細辛生物藥品的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。人工燈盞細辛種植技術勢在必行[15]。

但是人工種植燈盞細辛與野生燈盞細辛相比，有幾點不同。第一，生長環(huán)境。野生燈盞細辛生長環(huán)境不統(tǒng)一，如地勢高低、潮濕程度、陽光照射程度以及土地肥沃程度等，這造成了藥材質量難以控制。人工種植燈盞細辛則可避免這類問題。第二，人工因素影響。野生條件下，燈盞細辛生長狀態(tài)不夠穩(wěn)定，除了生長環(huán)境的不一樣，還有各種自然災害或者蟲類影響。人工種植的燈盞細辛在人為因素的保障下，產(chǎn)量質量能夠進一步提高。第三，藥材采收。野生燈盞細辛分布廣，不夠集中，采收人員復雜，并且采收之后藥材的處理因人而異，不夠統(tǒng)一，為了增加經(jīng)濟效益，一般連根拔起。這種情況使企業(yè)回收以及藥材加工提高了難度。人工種植燈盞細辛統(tǒng)一采收并處理，只采收地上部分，而非全草。

由于各種因素的影響，野生藥材與人工種植的藥材在某些方面存在較大的差異。所以，在用于大生產(chǎn)時，人工種植與野生的燈盞細辛藥材應有不同的提取工藝。

1 儀器、材料與試劑

1.1 儀 器

UV-2600紫外可見光分光光度計，島津；AL104電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；HHS21-8數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；GZX-9140 MBE電熱干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.2 材 料

人工種植燈盞細辛干燥生藥，云南白藥大理藥業(yè)提供，批號YP20191101、YP20191001M干燥生藥。

1.3 試 劑

95%乙醇；總黃酮對照品蘆丁(批號：100080-201811)，中國食品藥品檢定研究院；亞硝酸鈉，國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉，國藥集團化學試劑有限公司；硝酸鋁，天津市風船化學試劑科技有限公司；所有化學試劑均為分析純級，所有用水均為二次蒸餾水。

2 提取工藝的條件研究與篩選

2.1 理論依據(jù)

按照野生燈盞細辛的提取工藝為基準，預實驗過后，在此基礎上進行調(diào)整，確定考察因素及水平。

2.2 提取工藝優(yōu)化

本實驗方案將溶劑量、回流時間、乙醇濃度、提取次數(shù)設為四個考察因素，結合大生產(chǎn)條件，在三水平下比較對人工種植燈盞細辛總黃酮的得率。運用正交法[16]，觀察實驗結果，綜合分析，選出最優(yōu)組合。正交試驗設計各因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平

根據(jù)因素水平表，選用L9(34)正交試驗，見表2。

表2 乙醇回流提取工藝正交試驗結果

2.3 供試品溶液的制備

人工種植燈盞細辛干燥生藥100 g，按正交試驗表所列條件90 ℃回流提取、過濾、擠壓、合并提取液。提取液濃縮至浸膏后在烘箱進行8 h干燥，精密稱取干燥浸膏粉末0.25 g，用60%乙醇溶解，置100 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻即得。

2.4 總黃酮含量的測定

2.4.1 對照品溶液的制備

精密稱取無水蘆丁對照品20 mg，置100 mL量瓶中，加60%乙醇適量，必要時置水浴上微熱使溶解，放冷，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取25 mL置50 mL量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 mL含無水蘆丁0.1 mg)。

圖1 提取流程圖

2.4.2 標準曲線的制備[17]

精密吸取標準溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，各加30%乙醇，定容至5.0 mL，精密加入50 mg/mL亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加100 mg/mL硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，再放6 min，加氫氧化鈉試液4.0 mL，再分別加水稀釋至刻度，搖勻，放置15 min，用第一個容量瓶做空白，照紫外-可見分光光度法[18]，在 510 nm波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2.4.3 測定法

精密吸取配置好的溶液0.4 mL，置10 mL容量瓶中，照標準曲線項下的方法自“各加30%乙醇使成5.0 mL，精密各加亞硝酸鈉溶液” 起依法測定吸收度，從標準曲線上求出供試品中蘆丁的重量(mg)，計算，即得。

2.5 最優(yōu)條件工藝驗證

以本研究優(yōu)化的工藝條件，按2.3項下供試品溶液的制備法，按2.4項下測定法，計算總黃酮含量。重復三次，取平均值。

3 結 果

3. 1 標準曲線

以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線后，得回歸方程：Y=12.9373X+0.0054，相關系數(shù)r=0.9998(n=6)。

3. 2 正交試驗考察

回流提取工藝考察結果(見表2)，從極差直觀分析結果，可看出人工種植燈盞細辛總黃酮乙醇回流提取的最佳提取工藝為 A3B3C2D3，即6倍量濃度為65%的乙醇，90 ℃下回流提取3次，每次提取2 h。從極差R值可以看出，影響總黃酮提取率的因素依次為：D>A>B>C，即提取次數(shù)>溶劑量> 回流時間>乙醇濃度。

3.3 最優(yōu)工藝驗證結果

在本研究優(yōu)化的工藝條件下，重復三次，取平均值。人工種植燈盞細辛干燥生藥總黃酮的得率為6.87%，通過換算，總黃酮含量為6.87%(RSD=1.66%)(即100 g燈盞細辛干燥生藥中總黃酮含量為6.87 g左右)。以往研究顯示，野生干燥藥材中總黃酮含量都在5%左右[19-20]，相對于野生藥材，人工種植燈盞細辛總黃酮絕對含量更高。

4 結 論

本研究采用 L9(34)正交試驗對野生燈盞細辛總黃酮提取工藝進行調(diào)整，篩選了適合人工種植燈盞細辛的提取方案，即溶劑量為6倍，每次回流時間2 h，乙醇濃度65%，提取3次。在此條件下，總黃酮含量為藥材的6.87%，驗證了人工種植燈盞細辛總黃酮絕對含量遠遠高于野生燈盞細辛。但是人工藥材提取浸膏中其他成分收率太高，導致浸膏中總黃酮百分含量反而比野生藥材提取浸膏低，所以人工種植燈盞細辛提取浸膏需要經(jīng)過一定的純化才能運用于大生產(chǎn)。本文針對人工種植燈盞細辛藥材進行提取工藝的篩選以及總黃酮有效成分含量進行了評估，為人工種植資源的進一步開發(fā)利用提供了科學依據(jù)。