HPLC-ELSD法測(cè)定新霉素氟輕松乳膏中新霉素的含量

文 藝，王寶藝，侯響玲，秦 波

(八加一藥業(yè)股份有限公司，廣西 桂林 541000)

新霉素氟輕松乳膏為一種白色乳膏劑，在臨床醫(yī)學(xué)上適用于各類炎癥，現(xiàn)已收載國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)。其最主要組分為硫酸新霉素，原無(wú)含量測(cè)定，現(xiàn)中國(guó)藥典已有記載采取微生物檢定的方法來(lái)測(cè)定硫酸新霉素的含量[1]，為加強(qiáng)藥品質(zhì)量控制，閱覽相關(guān)文獻(xiàn)[2-5]，本文設(shè)立了HPLC - ELSD法測(cè)定新霉素氟輕松乳膏中新霉素的含量，HPLC-ELSD法具有高效能與高速度、高靈敏度、高專屬性、高精密度、高準(zhǔn)確度，能夠有效保證藥品制劑質(zhì)量，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)含量測(cè)定添加了依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters2695高效液相色譜儀(Waters Empower色譜工作站)，美國(guó)沃特世公司；ELSD2000ES蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，美國(guó)奧泰公司；XS205DU電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

新霉素氟輕松乳膏(批號(hào)分別為200705，190806和180302)，市售某藥廠；新霉素標(biāo)準(zhǔn)品(濃度為645 U/mg，批號(hào)為130309-201512)，中國(guó)藥品生物制品檢定研究院；乙腈為(色譜純)，德國(guó)merk公司；水為超純水；其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18(250 mm×4.6 mm， 5 μm)，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1 mol·L-1三氟乙酸分析純?nèi)芤海捎锰荻认疵摚?～5 min為20%A，6～14 min為40%A；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器加熱管的溫度為105 ℃，載氣流速為2.6 L·min-1，色譜柱溫度為25 ℃，流速0.8 mL·min-1，進(jìn)樣量為20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液

取用新霉素標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，用水約10 mL使新霉素溶解后，再加水定容至刻度，搖勻，得每毫升含0.1436 mg新霉素對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液

取樣品適量，精密稱定(約相當(dāng)于新霉素7 mg)，置于 50 mL容量瓶中，用水約25 mL溶解本品，微微振搖后置于 80 ℃恒溫水浴鍋里加熱6 min，邊加熱邊振搖勻，待新霉素溶解后，置于超聲儀常溫超聲5 min，取出后將其放冷至室溫，最后加水稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液

按照制配處方工藝制備加入除新霉素外的其他藥用輔料，配制成陰性樣品，照“2.2.2”項(xiàng)下樣品處理方法平行處理新霉素氟輕松乳膏陰性樣品，得陰性樣品溶液。

2.3 專屬性考察

取上述的對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各 20 μL，依照“2.1”的色譜條件，分別以進(jìn)樣量20 μL注入液相色譜儀，逐一記錄好色譜圖，見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明新霉素不被制劑中的其他組分干預(yù)。

圖1 HPLC-ELSD色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

依照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備成0.0378 mg·mL-1、0.0756 mg· mL-1、 0.1513 mg·mL-1、 0.3025 mg·mL-1、0.6050 mg·mL-1系列對(duì)照品溶液，分別精密吸取各20 μL，注入高效液相色譜儀，以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以峰面積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得新霉素線性方程Y=0.0453X+5.7696，r=0.9999。結(jié)果顯示，新霉素質(zhì)量濃度在0.0378～0.6050 mg·mL-1范圍內(nèi)和峰面積呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取適量“2.2.1 ”配制的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依照上述色譜條件，進(jìn)樣量20 μL，連接進(jìn)樣6次，新霉素色譜峰面積RSD為0.67%，結(jié)果顯示精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批樣品(生產(chǎn)批號(hào)190806)溶液分別于2 h、4 h、 8 h、12 h、18 h、24 h下各進(jìn)樣20 μL，記錄各峰面積，RSD為2.65%，說(shuō)明新霉素在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品(生產(chǎn)批號(hào)190806)6份，依照“2.2.2”項(xiàng)下樣品處理平行測(cè)定6次，得新霉素的含量平均值為2.35 mg·g-1，RSD為0.38%。結(jié)果顯現(xiàn)重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

稱取新霉素氟輕松乳膏約1 g置于50 mL容量瓶中，分別按標(biāo)示量的150%、100%、50%加入新霉素對(duì)照品，依照供試品制配方法配制溶液，按上述色譜條件，各以20 μL進(jìn)樣，注入液相色譜儀，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為96.6%，RSD為0.48%(n=9)，見(jiàn)表1，結(jié)果表明新霉素回收率良好。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.9 樣品測(cè)定

取“1.2”項(xiàng)下3批新霉素氟輕松乳膏樣品，按供試品配制方法制備溶液，以上述色譜條件測(cè)定其含量，見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

3.1 新霉素氟輕松乳膏的提取條件的確立

新霉素極易溶于水，對(duì)新霉素的提取，考慮其他組分對(duì)新霉素的的影響，曾用100%甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇約25 mL溶解樣品，待溶解后用三級(jí)水稀釋至刻度以取供試品，所測(cè)新霉素含量極不穩(wěn)定，待不斷摸索，表明用三級(jí)水、水浴、超聲后能完全提取，因而使用三級(jí)水溶解。分別采取時(shí)間為2 min、5 min兩種超聲方式處理，結(jié)果表明超聲5 min可使主成分完全溶解。

3.2 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)過(guò)程曾采用乙腈-0.1 mol·L-1三氟乙酸、甲醇- 0.1 mol·L-1三氟乙酸比例分別為(20:80)和(10:90)為流動(dòng)相測(cè)定，結(jié)果顯示對(duì)照品峰形較差；后采取乙腈-0.1 mol·L-1三氟乙酸梯度洗脫，結(jié)果顯現(xiàn)各峰峰形和分離度較好，且出峰時(shí)間適宜，因此，將其作為本實(shí)驗(yàn)研究的流動(dòng)相條件。

3.3 建立HPLC-ELSD法含量測(cè)定的意義

因自身結(jié)構(gòu)限制，新霉素在紫外光譜下沒(méi)有特定吸收峰，因此不能用紫外-可見(jiàn)分光檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)。ELSD是通用型檢測(cè)器，靈敏度高，對(duì)所有物質(zhì)均有響應(yīng)，其性質(zhì)適宜與色譜聯(lián)合運(yùn)用來(lái)測(cè)定化合物的含量。目前已有不少運(yùn)用ELSD來(lái)解析氨基糖苷類抗生素含量的相關(guān)報(bào)道。

4 結(jié) 論

本文建立了HPLC-ELSD法測(cè)定新霉素的含量，為有效控制氨基糖苷類抗生素的質(zhì)量提供了新路徑。本文所建立的方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可為新霉素氟輕松乳膏的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。