基于網絡藥理學解析復方血栓通膠囊改善微循環的作用機制*

2022-04-12 03:15:36畢聰吳灝王永剛彭維蘇薇薇劉宏

中山大學學報(自然科學版)(中英文) 2022年2期

畢聰，吳灝，王永剛，彭維，蘇薇薇，劉宏

中山大學生命科學學院/廣東省中藥上市后質量與藥效再評價工程技術研究中心，廣東廣州 510275

復方血栓通膠囊由三七、黃芪、丹參、玄參四味藥材組成，系廣東眾生藥業股份有限公司獨家生產的名優中成藥品種，具有活血化瘀，益氣養陰的功效，臨床上主治血瘀兼氣陰兩虛證的視網膜靜脈阻塞及穩定性勞累型心絞痛［1］。研究表明，視網膜靜脈阻塞［2］、急性心肌梗死［3］、動脈粥樣硬化［4］等疾病與微循環障礙密切相關，而復方血栓通膠囊改善微循環的作用靶點與機制尚不明晰。本文基于網絡藥理學技術，通過篩選微循環相關活性成分與作用靶點，構建藥材-成分-靶點-通路綜合網絡，解析復方血栓通膠囊改善微循環障礙的作用機制。

1 實驗方法

1.1 微循環障礙靶點獲取

利用GeneCards（https：//old. tcmsp-e. com/tcmsp. php）和OMIM（https：//omim. org/）數據庫［5］，以microcirculation 為關鍵詞，選擇“Relevance score≥4.0”的基因。同時搜索文獻中與微循環障礙相關的基因，去除重復基因。

1.2 復方血栓通膠囊化學成分及作用靶點獲取

利用中藥系統藥理數據庫（TCMSP）（http：//tcmspw. com/tcmsp. php）數據庫［6］，以“三七”“黃芪”“丹參”“玄參”為關鍵詞，選擇口服生物利用度（OB，oral bioavailability）≥30%、化合物類藥性（DL，drug-like）≥0.18［7］的化學成分用于下一步分析。利用TCMSP 數據庫及參考文獻獲取各化學成分的作用靶點，并將所得靶點通過UniProt 數據庫（https：//www.uniprot.org/）轉化為基因名稱。

1.3 活性成分及改善微循環靶點篩選

采用Venny 平臺（https：//bioinfogp. cnb. csic.es/tools/venny/）將微循環相關靶點與復方血栓通膠囊作用靶點取交集，作為復方血栓通膠囊改善微循環障礙潛在作用靶點。與潛在作用靶點相關聯的成分作為復方血栓通膠囊的活性成分。

1.4 蛋白相互作用（PPI）網絡構建及核心基因篩選

將復方血栓通膠囊微循環潛在作用靶點導入STRING（https：//string-db.org/）［8］平臺，蛋白種屬選擇“Homo sapiens”，最低相互作用得分選擇中等置信度“medium confidence（0.4）”。將“TSV”格式數據導入Cytoscape［9］，構建PPI 網絡，并利用“Network Analysis”的“Generate style from statistics”功能將PPI 網絡可視化。利用“cytoHubba”功能篩選核心基因。

1.5 生物功能與通路富集分析

利用DAVID 數據庫（https：//david. ncifcrf. gov/）對潛在作用靶點進行GO（gene ontology）功能分析，利用Cytoscape 中“ClueGO、CluePedia”插件對潛在作用靶點進行KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）信號通路分析［10］，并利用GraphPad軟件將結果可視化。

1.6 活性成分-改善微循環靶點-通路網絡構建

將復方血栓通膠囊活性成分、改善微循環潛在作用靶點、KEGG 通路導入Cytoscape，構建活性成分-靶點-通路網絡。其中，節點代表活性成分、基因或通路，連線代表生物分子的作用關系，以度值和介數作為評價節點在網絡中重要性的參數。

2 結果

2.1 改善微循環靶點及活性成分篩選

通過GeneCards、OMIM 數據庫及文獻檢索，共獲取微循環相關靶點187 個，利用TCMSP 數據庫及文獻檢索，共獲取復方血栓通膠囊作用靶點151 個。取二者靶點交集（圖1），篩選得到復方血栓通膠囊改善微循環的潛在作用靶點40 個（表1）、關聯活性成分41 個（表2）。其中，歸屬三七的活性成分有7個，為人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、三七素等皂苷類成分；歸屬丹參的有20 個，為丹參酮ⅡA、隱丹參酮等丹參酮類成分和迷迭香酸、丹酚酸B、原紫草酸等酚酸類成分；歸屬黃芪的有8 個，為芒柄花素、毛蕊異黃酮等黃酮類成分和黃芪甲苷等皂苷類成分；歸屬玄參的成分有6個，為哈巴俄苷等環烯醚萜類成分和安格洛苷C等苯丙素苷類成分。

圖1 復方血栓通膠囊作用靶點與微循環靶點交集韋恩圖Fig.1 The Venn diagram of targets of CXC and microcirculation

表1 復方血栓通膠囊改善微循環潛在作用靶點Table 1 The potential targets of CXC to improve microcirculation

表2 復方血栓通膠囊改善微循環活性成分Table 2 The active compounds of CXC to improve microcirculation

2.2 蛋白互作網絡構建（PPI）及核心基因篩選

利用STRING數據庫、Cytoscape，構建40個復方血栓通膠囊微循環潛在作用靶點的PPI 網絡圖（圖2），篩選出核心基因（圖3）為IL6、CCL2、ICAM1、EDN1、JUN、NOS3、PTGS2、VCAM1、MMP9、TNF。結果提示這些靶點可能在復方血栓通膠囊改善微循環障礙的作用中發揮核心作用。

圖2 復方血栓通膠囊改善微循環潛在作用靶點互作網絡圖Fig.2 The protein-protein interaction network of CXC to improve microcirculation

圖3 靶點互作網絡中的核心基因Fig.3 The hub genes in the protein-protein interaction network

2.3 GO功能富集分析

分別以生物過程（BP，biological process）、細胞組分（CC，cellular components）和分子功能（MF，molecular function）對復方血栓通膠囊微循環潛在作用靶點進行功能富集分析，列出顯著性最高的10條（圖4～6）。結果表明，在生物過程方面，主要富集于inflammatory response、lipopolysaccharidemediated signaling pathway、response to hypoxia 等，涉及炎癥反應、脂多糖信號通路、白細胞遷移、缺氧反應等；在細胞組分方面，主要富集于extracellular space、external side of plasma membrane、blood microparticle 等，涉及細胞外間隙、質膜外層、細胞外基質、細胞連接、血液微粒等，可能主要通過作用于細胞表面或細胞間物質發揮作用；在分子功能方面，富集于serine-type endopeptidase activity、heme binding、transmembrane signaling receptor activity 等方面，涉及絲氨酸型內肽酶活性、血紅素結合、跨膜受體活性、一氧化氮合酶活性等。

圖4 復方血栓通微循環潛在作用靶點的生物過程富集分析Fig.4 Biological process analysis of potential targets of CXC to improve microcirculation

圖5 復方血栓通微循環潛在作用靶點的細胞組分富集分析Fig.5 Cellular components analysis of potential targets of CXC to improve microcirculation

圖6 復方血栓通微循環潛在作用靶點的分子功能富集分析Fig.6 Molecular function analysis of potential targets of CXC to improve microcirculation

2.4 KEGG通路富集分析

對復方血栓通膠囊微循環潛在作用靶點進行KEGG 通路分析，共富集到了107 條通路，篩選富集靶點數排名前20 的通路（圖7）。結果表明，復方血栓通膠囊可作用于血管相關通路Fluid shear stress and atherosclerosis（血流剪切應力及動脈粥樣硬化）、HIF-1 signaling pathway（缺氧誘導因子1 信號通路）、Relaxin signaling pathway（松弛素信號通路），通過調節血液流變、擴張血管、促進血管生成、增加微循環血流灌注等改善微循環障礙；也可作用于免疫炎癥相關通路，如Complement and coagulation cascades（補體與凝血級聯反應）、TNF signaling pathway（腫瘤壞死因子信號通路）、IL-17 signaling pathway （白細胞介素17 信號通路）；作用于神經活性相關通路Neuroactive ligandreceptor interaction（神經活性配體-受體相互作用）以及糖尿病相關通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）。由此可見，復方血栓通膠囊改善微循環障礙，可能通過調節血液流變、擴張血管、促進血管生成、增加微循環血流灌注、調節炎癥免疫、神經活性等方面的靶點及通路而實現。

圖7 復方血栓通膠囊微循環潛在作用靶點的KEGG通路結果圖Fig.7 The KEGG pathways of potential targets of CXC to improve microcirculation

2.5 活性成分-靶點-通路網絡構建

將41 個活性成分、40 個作用靶基因、富集靶點數排名前10 的KEGG 通路導入Cytoscape，構建復方血栓通膠囊改善微循環的活性成分-靶點-通路網絡圖（圖8）。其中紫色菱形代表靶點，灰色三角為通路，圓形為活性成分（綠色為三七成分，黃色為丹參成分，藍色為黃芪成分，粉色為玄參成分）。

圖8 復方血栓通微循環相關活性成分-靶點-通路網絡圖Fig.8 The active compound-target-pathway network of CXC to improve microcirculation

3 小結與討論

微循環即微動脈和微靜脈之間的血液循環，是機體進行血液和組織間物質交換的場所。當機體受到某些病理因素的刺激時，出現血管炎癥和內皮功能異常，引起血液流速減慢或形成血栓，進而引發微循環障礙［11］。臨床數據表明，微循環障礙是造成糖尿病［12］、胰腺炎［13］、腦損傷［14］、膿毒癥［15］、心血管［16］等多種疾病的重要原因。已有研究表明，復方血栓通膠囊可顯著增加血流灌注量，擴張血管，從而改善視網膜、心肌組織的微循環障礙［1，17-18］。

本研究基于網絡藥理學，篩選出復方血栓通膠囊與改善微循環相關的41 個活性成分，主要為人參皂苷Rg1、三七皂苷R1等皂苷類成分，芒柄花素、毛蕊異黃酮等黃酮類成分，丹參酮ⅡA、隱丹參酮等丹參酮類成分，迷迭香酸、丹酚酸B等酚酸類成分，哈巴俄苷等環烯醚萜類成分，以及安格洛苷C等苯丙素苷類成分。篩選出復方血栓通膠囊與改善微循環相關的40 個潛在作用靶點，其中IL6、CCL2、ICAM1、EDN1、JUN、NOS3、PTGS2、VCAM1、MMP9、TNF發揮了關鍵作用。

復方血栓通膠囊微循環潛在作用靶點富集于心血管、免疫炎癥、神經活性及糖尿病相關通路。在心血管通路方面，HIF-1信號通路對微循環的建立有重要意義［19］，復方血栓通膠囊可直接調控HIF 信號通路中的核心基因HIF-1α（圖9），進而影響紅細胞生成、血管形成、鐵代謝、血管舒張等；也可調控下游血管內皮生長因子（VEGF）、纖溶酶原激活劑抑制劑-1（PAI-1），直接影響血管形成；以及調控內皮素（EDN-1）、一氧化氮合酶（iNOS、eNOS），調節血管舒張、血小板聚集以及血管平滑肌增生［20］。在炎癥方面，微循環內皮細胞被激活后，細胞間黏附因子-1（ICAM-1）、腫瘤壞死因子（TNF-α）和趨化因子等被大量釋放，引起白細胞聚集，同時影響血管通透性，形成微血管血栓［21］。復方血栓通膠囊可調控TNF 信號通路等炎癥相關通路（圖10），通過調控TNF-α、IL6、CCL2、MMP9、ICAM-1、VCAM-1、E-選擇素等，調控炎癥因子的釋放、白細胞黏附、血管重構、細胞黏附等。在神經活性方面，交感神經通過支配微血管的平滑肌，調節血管收縮舒張及微循環的血流量［22-23］。復方血栓通膠囊可通過調節乙酰膽堿受體2（CHRM2）、腎上腺素能受體（ADRB2）、糖皮質激素受體（NR3C1）、補體（C3、C5）等調控Neuroactive ligand-receptor interaction信號通路，從而影響微循環血流量。