miR-1247通過靶向CC趨化因子配體16調控肺炎幼鼠巨噬細胞極化和過敏性炎癥

秦霞 姚娟

肺炎是下呼吸道感染疾病，是5歲以下兒童死亡和發病的重要原因。急性小兒肺炎嚴重威脅兒童患者的生命[1]。因此，迫切需要闡明嬰兒性肺炎的關鍵機制[2]。最近研究表明，微小RNA(micro RNA,miRNA)可能具有塑造M1和M2巨噬細胞極化平衡的能力并歪曲免疫應答[3]。已經確定了幾種miRNA參與了肺炎的發病機制[4]。最近，miR-1247被證明可調節胃癌細胞的生長和遷移[5]。miR-1247的異位表達可以抑制胰腺癌細胞的惡性行為和致瘤性[6]。而且，miR-1247的抑制作用可促進非小細胞肺癌細胞的侵襲和遷移[7]。miR-1247在癌癥領域中的作用越來越多，但miR-1247對肺炎發展的影響尚不清楚。巨噬細胞是炎癥的起始，傳播和消退的主要參與者[8]。觸發巨噬細胞的激活對消除入侵的病原體或刺激至關重要[9]。但是，一旦清除了傳染性或有害性物質，就必須消除炎癥信號，以防止自身破壞。因此，應同時重視巨噬細胞的正確激活和從炎癥狀態到免疫抑制狀態的轉變[10]。本文對miR-1247通過靶向CCL16調控肺炎幼鼠巨噬細胞極化和過敏性炎癥進行詳細研究為嬰幼兒肺炎的診斷和治療提供理論基礎和新的見解。

1 材料與方法

1.1 動物實驗

1.1.1 實驗幼鼠:BALB/C幼鼠購自湖北醫藥學院動物試驗中心[動物合格證號：SCXK(鄂)2021-0008]，并維持在特定的無病原體條件下的醫學院動物設施中。所有實驗使用年齡和性別匹配的對照小鼠。

1.1.2 肺炎模型:腹膜內麻醉小鼠，加入鹽酸氯胺酮(100 mg/kg)和甲苯噻嗪(10 mg/kg)。氣管內滴注miR-1247模擬物(2 mg/kg)。24 h后，在指定的時間段內給予PBS或LPS(1 mg/kg，氣管內)。在LPS暴露后24 h處死小鼠，并進行隨后的功能分析。在短期研究中，LPS注射3 h后從小鼠收集血液，并測量血清中的細胞因子水平。

1.1.3 醫學倫理學問題:動物實驗均根據美國國立衛生研究院實驗動物的護理和使用指南，以及杭州師范大學醫學院動物護理和使用委員會的批準進行。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及腹膜巨噬細胞和肺泡巨噬細胞的產生:RAW264.7細胞系獲自美國典型培養物保藏中心，并在含有10%(V/V)熱滅活的FBS的DMEM(生命技術)中生長。為了制備鼠腹膜巨噬細胞，經腹膜內注射8周齡小鼠。含3%巰基乙酸鹽的肉湯。72 h后，收獲腹膜細胞，并通過快速粘附富集巨噬細胞。對于肺泡巨噬細胞，將收集的血液鋪在12孔板中，反復洗滌后通過粘附選擇巨噬細胞。

1.2.2 RNA分離和定量實時PCR分析:用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen，Hilden，德國)分離總RNA，并用SuperScript II(Life Technologies)合成cDNA模板。通過在ABI Prism 7300檢測系統上使用SYBR Green Universal 2x qPCR Master Mix(Applied Biosystems，Foster City，CA)，一式三份進行定量RT-PCR。如Livak和Schmittgen所述，使用2-ΔΔCT方法分析數據。將mRNA水平相對于內部對照基因(β-肌動蛋白)進行標準化。

1.2.3 質粒轉染和熒光素酶報告基因檢測:將編碼小鼠miR-1247的cDNA插入pcDNA3.1載體(Invitrogen)。使用QuickChange定點誘變試劑盒(Stratagene)通過PCR誘變靶向CCL16氨基酸殘基。將完整或突變的CCL16構建體與含有miR-1247啟動子的熒光素酶構建體一起通過JetPEI轉染試劑(PolyPlus)轉染到RAW細胞中。為了檢測miR-1247對CCL16表達的影響，從基因組DNA擴增了CCL16 3’非翻譯區(UTR)，并將其克隆到pMIR-REPORT載體(Ambion)中。通過基于PCR的定點誘變生成pMIR-CCL16-mut，以刪除miR-1247識別序列。使用siPORT NeoFX脂質體(Ambion)將pMIR-CCL16，pMIR-CCL16-mut或對照載體與miRNA共轉染到RAW細胞中。24 h后收獲細胞并分析熒光素酶活性。

1.2.4 免疫熒光:對于免疫熒光染色，在室溫下用PBS中的10%封閉血清封閉非特異性結合1 h，將組織樣品與針對綠色熒光蛋白(GFP；克隆4B10)和一抗孵育在4℃下過夜。加入與熒光偶聯的第二抗體，并將載玻片在室溫下孵育1 h。在相同條件下使用同型匹配的陰性對照抗體(R&D Systems)。細胞核用4’，6-二mid基-2-苯基吲哚(Invitrogen)復染色。將切片用ProLong金抗褪色試劑盒(分子探針，紐約州格蘭德島)安裝，并用裝有DS-Fi2相機(尼康)的Nikon Eclipse Ti-U顯微鏡觀察。

1.2.5 ELISA測定細胞因子水平:通過ELISA測量血液中TNF-α，IL-6和IL-10的水平。

1.2.6 流式細胞儀:細胞在冰冷的流式細胞儀緩沖液(PBS中的2%[V/V]FCS和2 mmol/L EDTA，pH值7.5)中洗滌。阻斷非特異性結合后，將細胞與熒光偶聯的Ab孵育30 min，并用流式細胞儀緩沖液洗滌3次。在適當的地方使用適當的同型對照。根據前向和側向散射對流式細胞術事件進行門控，選擇F4/80+細胞進行M1/M2標記分析。在FACSCalibur流式細胞儀(BD Biosciences)上獲取數據，并使用FlowJo(Tree Star)進行分析。

1.2.7 免疫印跡分析:通過在含有蛋白酶抑制劑混合物片劑(Roche Diagnostics)的裂解緩沖液(1%Triton X-100、1%脫氧膽酸鹽，0.1%NaN3)中裂解2×106個細胞來制備細胞裂解液。在10%SDS-聚丙烯酰胺微型凝膠上分離等量的蛋白質，轉移到Immobilon聚偏二氟乙烯膜(Millipore)上。在含有5%BSA的TBST中封閉后，將膜與適當的一級抗體孵育，與偶聯至HRP的二級抗體(Santa Cruz Biotechnology)孵育。使用ECL Western印跡試劑盒(Amersham Biosciences)可視化信號。所有實驗至少進行3次。

2 結果

2.1 miR-1247和CCL16 mRNA表達水平比較 肺炎抑制miR-1247表達，促進CCL16表達。肺炎組較對照組miR-1247 mRNA表達降低，CCL16 mRNA表達升高(P<0.05)。見圖1，表1。

2.2 熒光素酶測定miR-1247靶向CCL16 與模擬對照組比較，miR-1247模擬組抑制了CCL16 3’UTR野生型的相對熒光素酶活性(P<0.05)，miR-1247模擬組對CCL16 3’UTR突變型的相對熒光素酶活性沒有顯著影響，差異無統計學意義(P>0.05)。熒光素酶測定證實miR-1247靶向CCL16。見圖2，表2。

圖1 miR-1247和CCL16mRNA表達水平

表1 miR-1247和CCL16mRNA表達水平

圖2 CCL16和miR-1247的預測結合序列

表2 熒光素酶測定(光密度值)

2.3 miR-1247調控凋亡蛋白(Bcl-2 、Bax和Caspase-3)表達 肺炎組較對照組Bcl-2 表達降低，Bax和Caspase-3表達水平升高(P<0.05)，miR-1247模擬組較肺炎組Bcl-2 表達升高，Bax和Caspase-3表達水平降低(P<0.05)。見表3。

表3 凋亡蛋白的表達水平

2.4 miR-1247調控炎性因子(TNF-α、IL-6和IL-10)表達 肺炎組較對照組TNF-α和IL-6表達水平升高，IL-10表達水平降低(P<0.05)，miR-1247模擬組較肺炎組TNF-α和IL-6表達水平降低，IL-10表達水平升高(P<0.05)。見表4。

表4 炎性因子表達水平

2.5 M1和M2標記基因表達水平 miR-1247抑制M1標記基因表達，同時促進M2標記基因表達。肺炎組較對照組iNOS和IL-1β表達水平升高，Arg1和Mrc1表達水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，miR-1247模擬組較肺炎組iNOS和IL-1β表達水平降低，Arg1和Mrc1表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。數據表明，miR-1247在M1/M2巨噬細胞極化中起作用，miR-1247可以促進M1促炎性巨噬細胞的激活，同時限制M2極化巨噬細胞的發育。見表5。

表5 M1和M2標記基因表達水平

2.6 miR-1247抑制JNK活性以促進M2巨噬細胞發育 肺炎組較對照組p-p38、p-p65、p-ERK和p-JNK蛋白表達水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，miR-1247模擬組較肺炎組p-p38、p-p65、p-ERK和p-JNK蛋白表達水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表6，圖3。

表6 miR-1247抑制JNK活性

圖3 蛋白質免疫印跡檢測p-p38、p-p65、p-ERK和p-JNK蛋白表達水平

3 討論

巨噬細胞是高度可塑性的，它們的功能表型取決于微環境提示。LPS誘導肺炎過程中，巨噬細胞會發生稱為經典激活的巨噬細胞或M1巨噬細胞的表型，會產生高水平的促炎細胞因子，例如TNF-α、IL-6、IL-1β以及活性氧和氮物種[11]。相反，響應于諸如IL-4和IL-13的細胞因子，產生了交替活化的巨噬細胞，也就是M2巨噬細胞，并且高表達M2相關基因，例如甘露糖受體(Mrc)1/2，巨噬細胞半乳糖型鈣。型凝集素(Mgl)1/2，幾丁質酶3樣3(Chi3l3或Ym1)和精氨酸酶1(Arg1)[12]。M1巨噬細胞在保護宿主免受感染中起著中心作用，但它們也有助于炎癥和退行性疾病的發病機制。相反，M2巨噬細胞可抑制效應T細胞并促進腫瘤發展，但它們對消炎和組織修復有益。因此，極化的巨噬細胞反應的協調對于免疫力和體內平衡至關重要[13]。miRNA是一類內源性表達的小型非編碼RNA，可通過調節mRNA的穩定性和翻譯來調節基因表達。作為一種靈活而強大的調控系統，miRNA被認為是從發育、致癌到細胞增殖和分化等基本生物學過程的組成部分[14]。研究已經開始揭示miRNA在巨噬細胞激活和分化調控中的作用。

miRNA通過調節其靶基因而參與了廣泛的生物學過程，因此我們在本研究中研究了miR-1247的潛在靶基因。miR-1247在胚胎中高表達，并與肺發育，胎盤形成和細胞凋亡有關。事實證明，miR-1247的異常表達與前列腺癌，膀胱癌和結腸癌有關[15]。值得注意的是，miR-1247在與炎癥相關的肺部疾病(如肺纖維化，博來霉素或免疫復合物誘導的肺損傷和炎癥)中被誘導，表明miR-1247在肝癌、炎癥信號和肺部病理中的潛在作用。但是，miR-1247的確切作用和涉及的機制在很大程度上尚未確定。急性肺損傷是一種普遍存在的炎癥性肺部疾病，其特征是促炎性介質的過度生成，炎性細胞的積累以及血纖蛋白和浮腫液的沉積[16]。促炎性巨噬細胞的持續活化被認為在急性肺損傷的發病機制中起重要作用。然而，未能將促炎性M1轉化為抗炎性M2表型也說明了炎癥病理的進展。

我們的結果表明，CCL16被確認為miR-1247的功能靶基因。已發現CCL16是一種強大的炎性細胞因子，在潰瘍性結腸炎的炎性反應中起關鍵作用。CCL16也被認為是上皮來源的炎性介體，可在子宮內膜異位癥的發展中介導炎癥。CCL16在結節病患者的支氣管肺泡灌洗液中也被上調。這些數據暗示了CCL16在幾種疾病中的病理作用，包括炎性疾病。此外，肝表達的趨化因子/CCL16在嗜酸性粒細胞和肺炎嗜酸性粒細胞性肺炎患者的肺中積累中起著關鍵作用。在我們的研究中，敲低CCL16可以減輕LPS誘導的細胞損傷，而miR-1247抑制和CCL16敲低的組合可以逆轉單獨的CCL16敲低對LPS誘導的細胞損傷的影響。盡管尚未完全研究CCL16在肺炎中的作用，但我們的結果促使我們推測miR-1247可能通過靶向CCL16參與LPS誘導的急性肺炎。

我們證明了miR-1247抑制了M1偏向巨噬細胞的發育，同時促進了M2標記基因的轉錄。機制研究表明，miR-1247上調了B細胞淋巴瘤(Bcl)6的表達，抑制了JNK的激活和促炎性M1巨噬細胞的發育。

一項研究表明，隨著ARPE-19細胞中氧化應激的增加，miR-1247的表達上調，并且發現谷胱甘肽S-轉移酶pi 1(GSTP1)作為miR-1247的靶標[17]。此外，發現GSTP1的甲基化狀態與肺癌的發病機制和惡性程度相關。miR-1247是否通過靶向GSTP1在肺炎的發展中起關鍵作用還需要進一步研究。此外，還研究了miR-1247與JNK或NF-κB通路之間的關系，以進一步探索miR-1247的調節機制。JNK途徑是應激激活的蛋白激酶途徑之一，被發現與組織穩態有關。JNK信號通路是介導TNF-α/IL-32軸在調節氣道炎癥中的關鍵機制。銅綠假單胞菌定植可以通過JNK信號通路促進小鼠呼吸機相關性肺炎。另外，NF-κB信號通路是重要的細胞信號通路，也被發現與人類疾病有關。該途徑可在免疫和炎性反應中發揮關鍵作用，抑制κBα蛋白可以通過抑制NF-κB的活化來抑制嚴重的肺炎[18]。在我們的研究中，我們發現miR-1247超表達抑制了JNK和NF-κB途徑。因此，我們推測miR-1247-CCL16軸可能通過JNK和NF-κB途徑的激活而促進急性肺炎的發展。

綜上所述，miR-1247的過表達可通過靶向CCL16減輕肺炎幼鼠巨噬細胞損傷。JNK和NF-κB通路可能是調節miR-1247在肺炎幼鼠巨噬細胞損傷中的作用的關鍵機制。我們的發現將為嬰幼兒肺炎的治療提供有希望的治療策略。