絞股藍(lán)皂苷A調(diào)控lncRNA TTTY15/miR-335-5p通路對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制

牛帥帥 孫卓偉 王承群

骨關(guān)節(jié)炎是臨床常見(jiàn)的一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，主要特征為關(guān)節(jié)軟骨退化、滑膜炎癥及骨贅形成，目前骨關(guān)節(jié)炎藥物治療方案較少，同時(shí)非藥物治療的方案治療效果不佳[1]。近年來(lái)，中草藥在骨關(guān)節(jié)炎的治療中發(fā)揮重要作用，并可減輕骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷[2,3]。絞股藍(lán)皂苷是葫蘆科植物絞股藍(lán)的活性成分，具有抗氧化、保護(hù)神經(jīng)功能等作用，絞股藍(lán)皂苷可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，而抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激[4]。絞股藍(lán)皂苷A是皂苷的主要有效成分，但絞股藍(lán)皂苷A與骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷相關(guān)研究筆者所見(jiàn)相對(duì)較少。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是非編碼RNA中常見(jiàn)類(lèi)型，其在機(jī)體中廣泛存在，其表達(dá)異常可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA而參與多種疾病發(fā)生及發(fā)展，研究表明lncRNA TTTY15在過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中表達(dá)水平升高，敲低其表達(dá)可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-98-5p/CRP軸而減輕過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[5]。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示TTTY15與miR-335-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，研究表明miR-335-5p在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中表達(dá)水平降低，上調(diào)其表達(dá)可抑制軟骨細(xì)胞炎性反應(yīng)[6]。但絞股藍(lán)皂苷A是否可通過(guò)調(diào)控TTTY15/miR-335-5p通路而影響骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷尚未可知。因此，本研究采用IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞建立骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷模型，探討絞股藍(lán)皂苷A對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞炎癥、氧化應(yīng)激、增殖及凋亡的影響及其對(duì)TTTY15/miR-335-5p通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 絞股藍(lán)皂苷A購(gòu)自西安天豐生物；IL-1β購(gòu)自南京金斯瑞生物；SYBR Green PCR試劑購(gòu)自德國(guó)Qiagen；Trizol試劑、Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京天根生化；TNF-α、IL-6、SOD、MDA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物；miR-NC、miR-335-5p mimics、si-NC、si-TTTY15購(gòu)自上海吉瑪；pcDNA購(gòu)自上海聯(lián)邁生物；CCK-8試劑與凋亡試劑盒購(gòu)自北京索萊寶；兔抗人Bcl-2、Bax單克隆抗體與二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz。

1.2 方法

1.2.1 原代分離培養(yǎng)人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞[7]:選取2019年1月至2020年2月于我院接受人工膝關(guān)節(jié)置換的骨關(guān)節(jié)炎患者36例，其中男20例，女16例；年齡58～67歲，平均年齡(63.25±4.46)歲。取患者的軟骨組織，在無(wú)菌條件下去除多余的纖維結(jié)締組織后將其建成1 mm3的組織塊，PBS洗滌，加入0.25%胰蛋白酶消化，于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h，收集細(xì)胞后用200目濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞，1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清，加入DMEM培養(yǎng)基洗滌，將其接種于培養(yǎng)瓶(2.5×105個(gè)/ml)，于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組:將軟骨細(xì)胞分為Con組、IL-1β組、IL-1β+GpA-L組、IL-1β+GpA-M組、IL-1β+GpA-H組、IL-1β+GpA-H+pcDNA組、IL-1β+GpA-H+pcDNA-TTTY15組。除Con組外，每組加入10 ng/ml的IL-1β處理24 h[8]。含不同濃度(20、50、100 μg/ml)GpA與10 ng/ml的IL-1β的培養(yǎng)基共同處理IL-1β+GpA-L組、IL-1β+GpA-M組、IL-1β+GpA-H組的軟骨細(xì)胞24 h[9]。pcDNA、pcDNA-TTTY15分別轉(zhuǎn)染入軟骨細(xì)胞后用含有100 μg/ml GpA與10 ng/ml的IL-1β的培養(yǎng)基共同處理24 h。所有轉(zhuǎn)染步驟按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中TTTY15、miR-335-5p的表達(dá)水平:用Trizol試劑提取軟骨細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA合成cDNA，按照SYBR Green PCR試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循環(huán)。TTTY15以GAPDH為內(nèi)參，miR-335-5p以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算TTTY15、miR-335-5p相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)炎性因子TNF-α、IL-6的水平:收集各組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)TNF-α、IL-6的水平。

1.2.5 檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA的水平:收集各組軟骨細(xì)胞，采用反復(fù)凍融法裂解細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)SOD、MDA的水平。

1.2.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率:收集各組軟骨細(xì)胞接種于96孔板(1×103個(gè)/孔)，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后每孔加入10 μl CCK-8溶液，于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率:取各組軟骨細(xì)胞加入0.25%胰蛋白酶吹打細(xì)胞至懸浮狀態(tài)，加入500 μl 結(jié)合緩沖液，分別加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI，室溫避光孵育15 min，于1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)TTTY15與miR-335-5p的靶向關(guān)系:根據(jù)TTTY15與miR-335-5p的結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)建野生型載體WT-TTTY15，用基因突變技術(shù)對(duì)TTTY15與miR-335-5p互補(bǔ)序列進(jìn)行突變而構(gòu)建突變型載體MUT-TTTY15，熒光素酶報(bào)告基因載體分別與miR-NC或miR-335-5p mimics共轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞并檢測(cè)細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.2.9 Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá):收集軟骨細(xì)胞后提取細(xì)胞總蛋白，取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入Bcl-2(1∶800)、Bax(1∶800)一抗與內(nèi)參GAPDH(1∶1 000)稀釋液4℃孵育過(guò)夜，二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，ECL顯影，應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)及ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 絞股藍(lán)皂苷A對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎性因子、氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 與Con組比較，IL-1β組TNF-α、IL-6、MDA的水平升高(P<0.05)，SOD的活性降低(P<0.05)；與IL-1β組比較，IL-1β+GpA-L組、IL-1β+GpA-M組、IL-1β+GpA-H組TNF-α、IL-6、MDA的水平降低(P<0.05)，SOD的活性升高(P<0.05)，且GpA不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 絞股藍(lán)皂苷A對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎性因子、氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

2.2 絞股藍(lán)皂苷A對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖及凋亡的影響 與Con組比較，IL-1β組細(xì)胞存活率降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)；與IL-1β組比較，IL-1β+GpA-L組、IL-1β+GpA-M組、IL-1β+GpA-H組細(xì)胞存活率升高(P<0.05)，凋亡率降低(P<0.05)，Bax蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，且GpA不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表2。

圖1 絞股藍(lán)皂苷A對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的影響；A Western blot法檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量；B 細(xì)胞凋亡圖

表2 絞股藍(lán)皂苷A對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖及凋亡的影響

2.3 絞股藍(lán)皂苷A對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中TTTY15與miR-335-5p表達(dá)量的影響 與Con組比較，IL-1β組TTTY15的表達(dá)水平升高(P<0.05)，miR-335-5p的表達(dá)水平降低(P<0.05)；與IL-1β組比較，IL-1β+GpA-L組、IL-1β+GpA-M組、IL-1β+GpA-H組TTTY15的表達(dá)水平降低(P<0.05)，miR-335-5p的表達(dá)水平升高(P<0.05)，且不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 絞股藍(lán)皂苷A對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中TTTY15與miR-335-5p表達(dá)量的影響

2.4 TTTY15靶向調(diào)控miR-335-5p TTTY15與miR-335-5p存在結(jié)合位點(diǎn)。轉(zhuǎn)染miR-335-5p mimics可明顯降低野生型載體WT-TTTY15的熒光素酶活性(P<0.05)，而對(duì)含有MUT-TTTY15的細(xì)胞的熒光素酶活性無(wú)明顯影響。與si-NC組比較，si-TTTY15組miR-335-5p的表達(dá)水平升高(P<0.05)；與pcDNA組比較，pcDNA-TTTY15組miR-335-5p的表達(dá)水平降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2，表4、5。

圖2 LncBase Predicted v.2預(yù)測(cè)顯示TTTY15與miR-335-5p存在結(jié)合位點(diǎn)

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表5 TTTY15靶向調(diào)控miR-335-5的表達(dá)

2.5 TTTY15過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)絞股藍(lán)皂苷A對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎性因子、氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 與IL-1β+GpA-H+pcDNA組比較，IL-1β+GpA-H+pcDNA-TTTY15組miR-335-5p的表達(dá)水平降低(P<0.05)，TNF-α、IL-6、MDA的水平升高(P<0.05)，SOD的活性降低(P<0.05)。見(jiàn)表6。

2.6 TTTY15過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)絞股藍(lán)皂苷A對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖及凋亡的影響 與IL-1β+GpA-H+pcDNA組比較，IL-1β+GpA-H+pcDNA-TTTY15組細(xì)胞存活率降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3，表7。

表6 TTTY15過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)絞股藍(lán)皂苷A對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎性因子、氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

圖3 TTTY15過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)絞股藍(lán)皂苷A對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖凋亡的影響；A 細(xì)胞凋亡圖；B Western blot法檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量

表7 TTTY15過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)絞股藍(lán)皂苷A對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖及凋亡的影響

3 討論

目前從分子水平上分析發(fā)現(xiàn)抑制軟骨細(xì)胞凋亡及炎性反應(yīng)成為減緩骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的重要途徑，活性氧分泌量增加可誘發(fā)軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)及線(xiàn)粒體損傷，氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇可促使細(xì)胞凋亡進(jìn)而加重軟骨細(xì)胞損傷，部分傳統(tǒng)中草藥具有抗氧化、抗炎等作用，并可能作為治療骨關(guān)節(jié)炎的替代品[10]。但中草藥治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制尚未闡明。LncRNA在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷中表達(dá)異常，并可能作為治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在靶點(diǎn)[11]。但LncRNA是否可作為中草藥治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在靶點(diǎn)尚未闡明。

絞股藍(lán)總皂苷具有降血脂的作用，還具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[12]。絞股藍(lán)總皂苷可通過(guò)調(diào)控ROS/NF-κB通路而減輕LPS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷[13]。本研究結(jié)果顯示，IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中TNF-α、IL-6的水平升高，提示成功建立骨關(guān)節(jié)炎模型。本研究發(fā)現(xiàn)隨著絞股藍(lán)皂苷A濃度的升高，IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞TNF-α、IL-6的水平降低，且呈劑量依賴(lài)性，提示絞股藍(lán)皂苷A可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎性反應(yīng)。軟骨組織損傷可造成局部缺血缺氧導(dǎo)致細(xì)胞線(xiàn)粒體呼吸鏈的電子傳遞發(fā)生障礙，進(jìn)而促使氧自由基大量生成最終促使組織氧化損傷，MDA是一種脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，而SOD可清除氧自由基而減輕氧化損傷[14]。本研究結(jié)果顯示，IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞MDA水平升高，SOD活性降低，而絞股藍(lán)皂苷A可明顯降低MDA水平而增強(qiáng)SOD活性，提示絞股藍(lán)皂苷A可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激，且呈劑量依賴(lài)性。細(xì)胞增殖與凋亡異常可促使軟骨細(xì)胞損傷，細(xì)胞凋亡涉及多條凋亡信號(hào)通路及相關(guān)蛋白，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序時(shí)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平降低，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)升高，進(jìn)一步通過(guò)capsase家族蛋白的活化而執(zhí)行細(xì)胞凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示，IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞存活率降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高，而B(niǎo)cl-2蛋白水平降低；隨著絞股藍(lán)皂苷A劑量的增高，細(xì)胞存活率升高(P<0.05)，而凋亡率降低(P<0.05)，并可抑制Bax表達(dá)及促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，提示絞股藍(lán)皂苷A可促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖而抑制細(xì)胞凋亡。

為進(jìn)一步探究絞股藍(lán)皂苷A影響骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷的分子機(jī)制，本研究發(fā)現(xiàn)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中TTTY15的表達(dá)水平升高，而miR-335-5p的表達(dá)水平降低，隨著絞股藍(lán)皂苷A濃度的增高TTTY15的表達(dá)水平降低，而miR-335-5p的表達(dá)水平升高，提示絞股藍(lán)皂苷A可能通過(guò)抑制TTTY15的表達(dá)而促進(jìn)miR-335-5p的表達(dá)從而減輕骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷。研究表明，抑制TTTY15可通過(guò)靶向miR-455-5p而減輕缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[16]。TTTY15通過(guò)靶向miR-186-5p促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[17]。此外，報(bào)道指出骨關(guān)節(jié)炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-335-5p的表達(dá)下調(diào)，其可能是骨關(guān)節(jié)炎的保護(hù)基因之一[18]。miR-335-5p通過(guò)靶向c-jun-N端激酶3而改善阿爾茨海默病患者的認(rèn)知障礙[19]。本研究首次證實(shí)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中TTTY15可靶向結(jié)合miR-335-5p，并可負(fù)向調(diào)控miR-335-5p的表達(dá)。同時(shí)本研究結(jié)果顯示，TTTY15過(guò)表達(dá)后可明顯降低絞股藍(lán)皂苷A對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥及氧化應(yīng)激的抑制作用，還可降低細(xì)胞存活率而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示TTTY15過(guò)表達(dá)可通過(guò)負(fù)向調(diào)控miR-335-5p的表達(dá)而部分逆轉(zhuǎn)絞股藍(lán)皂苷A對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥、氧化應(yīng)激、增殖及凋亡的作用。

綜上所述，IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中TTTY15的表達(dá)水平升高，而miR-335-5p的表達(dá)水平降低，本研究證實(shí)TTTY15與miR-335-5p存在靶向關(guān)系，絞股藍(lán)皂苷A可降低TTTY15的表達(dá)水平，而升高miR-335-5p的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、凋亡及促進(jìn)細(xì)胞增殖，即TTTY15/miR-335-5p通路可能作為絞股藍(lán)皂苷A治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在途徑或靶點(diǎn)，可為揭示骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，還可為骨關(guān)節(jié)炎的治療提供新方向。