柴胡皂苷d對哮喘小鼠氣道炎癥及TLR4/NF-κB通路的影響

楊丹芬 康睿 謝圓媛 姜鵬飛

哮喘是一種以氣道慢性炎癥為特征的異質性疾病，臨床表現為嚴重的氣促、咳嗽、胸悶和呼吸時有喘息聲，其癥狀可能隨著時間和強度的不同而變化[1]。氣道炎癥是導致哮喘臨床癥狀發生的重要原因，可存在于哮喘的所有時段，與疾病的嚴重程度密切相關[2]。研究發現，Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)/核轉錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)通路能夠激活炎性因子作用于氣道上皮細胞，引起氣道炎癥、氣道高反應性等癥狀，在哮喘的發生、發展及預后轉歸中起到重要作用[3,4]。柴胡皂苷d(saikosaponin-d，SSd)是從柴胡中提取純化的主要生物活性成分之一，用于治療炎癥、感染性疾病和血管疾病，或作為保肝、抗菌或抗病毒藥物[5]。有研究發現，SSd可以顯著減輕四氯化碳引起的急性肝損傷，其機制可能是抑制肝組織中白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)和白介素-18等引起的炎癥級聯反應有關[6]。本研究通過建立哮喘小鼠模型，探討SSd對哮喘小鼠氣道炎癥及TLR4/NF-κB通路的影響，以期為臨床防治哮喘篩選新的治療藥物。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雌性BALB/c小鼠40只，6～8周齡，體重(18±2.0)g，由哈爾濱醫科大學動物實驗中心提供，動物合格證號：P00102008，動物使用許可證號：SYXK(黑)2018-033，自由飲水，通風換氣8次/h，其他均依照實驗動物飼養規則喂養。

1.2 藥品 卵清蛋白(ovalbumin，OVA)美國Sigma公司，阿奇霉素(Azithromycin，AZM)(東北制藥集團沈陽一廠生產，批號191008，0.25 g/支)；SSd(麥克林公司，CAS號：20874-52-6，批號：2018 MK-24)；兔抗人TLR4、NF-κB、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-1β一抗(貨號ab211573、ab188183、ab215188、ab197447，英國Abcam公司)；羊抗兔IgG EnVison 二抗(貨號：7074P2，美國CST公司)；Trizol試劑(貨號15596026，美國Invitrogen公司)；熒光定量試劑盒(貨號RR036A，大連TaKaRa公司)；BCA試劑盒(貨號A53225，美國賽默飛公司)；考馬斯亮藍試劑盒(貨號B8226，美國APExBIO公司)。引物由南京金斯瑞生物公司合成提供。

1.3 實驗設備 全自動數碼凝膠圖像分析系統(型號Tanon 1600，上海天能公司)；高速離心機(型號LG10-2.4A，北京醫用離心機長)；光學顯微鏡(貨號CX43，濟南歐萊博電子商務有限公司)；SDS-PAGE電泳儀、電轉化儀(貨號JY-SCZ2+、ZY5，北京君意生物科技有限公司)；超聲霧化器(型號DRS-06A，廣東多樂信電器有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 動物模型制作：健康雌性小鼠40只適應性觀察喂養1周，隨機抽取6只作為對照組，其余小鼠用于造模，均給予普通飼料喂養。參考孫麗平等[7]略加改進，首先單手固定小鼠，使其腹部向上，分別在試驗開始的第1天和第13天給予腹腔注射0.1 ml[OVA 20 μg和Al(OH)3 1 mg]的混懸液致敏，第21天開始，將小鼠置于5 L密閉容器中，用2% OVA 0.9%氯化鈉溶液溶液10 ml進行霧化吸入激發30 min，直到出現哮喘樣發作為止，連續激發10 d，試驗中若小鼠出現煩躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、大小便失禁即為陽性反應，表明造模成功。排除死亡或造模不成功的4只小鼠，共造模30只。

1.4.2 動物分組、計量設置及給藥方法：驗證成功的小鼠隨機分成5組，包括模型組(n=6)、AZM組(n=6)、低、中、高劑量SSd組(每組n=6)。AZM組按1次/d，250 mg/kg劑量，于第14天開始每天于激發前30 min腹腔注射給藥，共給藥14 d[8]。SSd低中高劑量分別為1.0、1.5、2.0 mg/kg，腹腔注射給藥，1次/d，共給藥14 d[7]。對照組和模型組給予等量0.9%氯化鈉溶液。

1.4.3 6組小鼠免疫細胞的檢測：造模后每天觀察小鼠一般狀況；最后一次給藥結束2 h后，采用0.3%的戊巴比妥鈉溶液0.1～0.2 ml/10 g麻醉小鼠，剪掉小鼠頸部皮毛，剪開皮膚，分離氣管周圍組織，氣管作一橫行切口，插入氣管插管。結扎右主氣管，經氣管插管注入10 ml 0.9%氯化鈉溶液，分3次灌注左肺，回收支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，3 000 r/min離心10 min，棄上清液，用0.9%氯化鈉溶液重懸沉淀。Diff-Quik染色液染色BALF細胞圖片，然后分類進行細胞計數。

1.4.4 HE染色觀察6組小鼠肺臟組織變化：小鼠采血后，解剖小鼠，取右側肺門組織，使用二甲苯浸泡，酒精梯度脫水，蘇木精浸泡、鹽酸酒精分化，最后氨水沖洗，并重復酒精沖洗過程，使用伊紅染色，酒精、二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ浸泡，中性樹膠封片。使用光學顯微鏡觀察小鼠肺臟組織結構。

1.4.5 qRT-PCR法檢測小鼠肺臟中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA水平：每組6只小鼠取右側肺門部位組織約100 mg，將組織放入研磨器中，加入約2 ml PBS，離心取上清。按照Trizol法提取肺臟中總RNA，根據逆轉錄試劑盒說明將RNA反轉錄為cDNA。參照SYBR Premix Ex Taq TM 試劑盒說明書進行qRT-PCR反應，反應體系為20 μl：2×SYBR Mix 10 μl，H2O 8 μl，上下游引物各0.5 μl，模板1 μl。反應條件為：95℃ 預變性5 min，95℃ 變性10 s、60℃ 退火30 s，72℃ 2 min，40個循環，72℃延伸10 min。以GAPDH基因為內參，采用2-ΔΔCt方法計算肺臟中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA相對表達量。見表1。

1.4.6 免疫印跡法(WB)檢測小鼠肺臟中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β 蛋白表達水平：每組6只小鼠取右側肺門部位組織約50 mg，加入6倍量冷蛋白裂解液，制成緩沖液。取一定量蛋白上樣，于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分離的蛋白質轉移至PVDF膜。5%脫脂奶封閉2 h，加入TLR4、NF-κB(1∶1000)、TNF-α(1∶5 000)、IL-1β(1∶2 500)單克隆抗體，4℃孵育過夜，TBST清洗5 min×3次。加入羊抗兔IgG二抗(稀釋倍數1∶15 000)，室溫下孵育2 h，TBST清洗后ECL顯色后置于凝膠成像儀中觀察各組蛋白表達情況。實驗采用Image J軟件對WB條帶進行采集分析，并計算目的條帶與相應內參β-actin的灰度值。

2 結果

2.1 一般狀態觀察 對照組小鼠活動正常，對外界反應靈敏，皮毛光澤，飲食、飲水正常；模型組小鼠呼吸急促、煩躁易怒、大小便失禁、口腔周圍青紫、反應遲鈍、毛色暗淡；AZM組小鼠飲食、飲水正常，活動較多；SSd組小鼠較模型組癥狀減輕，活動基本正常，飲食、飲水逐漸恢復，劑量越高狀態越好。

2.2 6組小鼠免疫細胞檢測結果比較 與對照組相比，模型組小鼠BALF中中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞均升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，AZM組、低中高劑量SSd組小鼠BALF中中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與AZM組相比，高劑量SSd組小鼠BALF中中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 6組小鼠細胞免疫檢測結果比較

2.3 小鼠肺臟組織病理學變化 對照組小鼠氣道上皮黏膜完整，纖毛排列整齊，無水腫或黏性分泌物，氣道周圍無炎癥細胞浸潤，肺泡璧結構完整；模型組小鼠氣道組織出現出血、肺泡間隙炎性細胞聚集、肺泡璧增厚及肺間質和肺泡水腫；AZM組小鼠炎性細胞浸潤顯著減輕，肺泡結構完整；低中高劑量SSd治療組小鼠炎性細胞浸潤、毛細血管充血、出血和肺泡璧增厚程度逐漸減輕。見圖1。

2.4 6組小鼠肺臟中TLR4、NF-κB、TNF-α及IL-1β mRNA水平比較 與對照組相比，模型組小鼠肺臟中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA水平均升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，AZM組及低中高劑量SSd組TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA水平均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。與AZM組相比，高劑量SSd組水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 6組小鼠肺臟中TLR4、NF-κB、TNF-α及IL-1β mRNA水平比較

2.5 6組小鼠肺臟中TLR4、NF-κB、TNF-α及IL-1β蛋白表達水平比較 與對照組相比，模型組小鼠肺臟中TLR4、NF-κB、TNF-α及IL-1β蛋白水平均升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。與模型組相比，AZM組及低中高劑量SSd組TLR4、NF-κB、TNF-α及IL-1β蛋白水平均降低(P<0.05)。與AZM組相比，高劑量SSd組水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表4，圖2。

表4 6組小鼠肺臟中TLR4、NF-κB、TNF-α及IL-1β蛋白表達水平比較

圖2 6組小鼠肺臟組織TLR4、NF-κB、TNF-α及IL-1β蛋白表達水平

3 討論

哮喘通常被認為好發于兒童和青少年，但實際上，>65歲人群發病率也在逐年增長，而與哮喘有關的誘因在不斷被探索，如過敏、氣道收縮/炎癥、病毒感染、空氣污染、運動、身體和精神壓力等[9]。現代研究認為哮喘的發病主要是固有免疫與適應性免疫相互作用的結果，兩者共同導致了氣道炎癥的發生。固有免疫細胞主要由巨噬細胞、樹突狀細胞等參與，其通過Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)等途徑，激活細胞內信號通路，主要參與微生物感染和組織損傷導致的急性炎性反應，并激活適應性免疫；同時適應性免疫主要通過輔助性T淋巴細胞2介導細胞因子、趨化因子、信號通路等參與哮喘的發生、發展過程[10]。因此探討哮喘的免疫機制可能有助于揭示哮喘的致病原因，并為臨床治療哮喘提供依據。

SSd屬環氧醚型五環三萜類齊墩果烷衍生物，多項研究表明，其具有抗炎、免疫調節、抗病毒和抗癌活性[11]。例如，SSd能通過抑制NF-κB信號轉導途徑，減緩阿爾茨海默病小鼠海馬小膠質細胞和星形膠質細胞的活化，降低患病小鼠海馬組織TNF-α、IL-1β及凋亡相關蛋白水平，改善小鼠病情[12]。研究發現，SSd還可抑制支氣管痙攣和呼吸道嗜酸性粒細胞/中性粒細胞的積聚，且呈劑量依賴性[13]。中性粒細胞具有趨化、吞噬作用和殺菌作用，與細胞的吞噬和消化功能有關，在急性和化膿性感染疾病中水平升高；巨噬細胞來源于單核細胞，參與固有免疫和特異性免疫，主要以固定細胞的形式對細胞殘片及病原體進行吞噬和消化，并激活淋巴球或細胞免疫；淋巴細胞由淋巴器官產生，是機體免疫應答的重要細胞成分，具有免疫識別及產生特異性抗體的功能；嗜酸性粒細胞通過吞噬抗原抗體復合物，釋放多種溶酶體酶，并促進炎性反應，可殺滅細菌、寄生蟲。中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞在咳嗽變異型哮喘[14]、哮喘模型小鼠氣道炎癥[15]等多種哮喘疾病中水平顯著升高，參與哮喘的發生、發展過程。本研究發現，對照組小鼠皮毛光澤、活動正常，氣道上皮黏膜完整，周圍無炎癥細胞浸潤；模型組小鼠呼吸急促、煩躁易怒、大小便失禁、毛色暗淡，BALF中中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞均升高，氣道組織出現出血、肺泡間隙炎性細胞聚集等癥狀。提示模型組小鼠出現典型哮喘癥狀，造模成功。SSd組小鼠較模型組癥狀減輕，且劑量越高狀態越好，BALF中中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞均降低，炎性細胞浸潤、毛細血管充血、出血和肺泡璧增厚程度逐漸減輕。提示SSd具有減輕哮喘小鼠氣道炎癥水平，改善哮喘病情的作用。

TLRs是一個識別入侵病原體和內源性有害刺激以誘導固有免疫和適應性免疫反應的模式識別受體亞家族[16]。在TLRs中，TLR4是主要的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)受體[17]。當TLR4在細胞膜上表達時，它與共受體髓樣分化蛋白-2(Co-receptor myeloid differentiation protein-2，MD-2)以復合物的形式存在，LPS的刺激促使TLR-4、MD-2形成TLR4-MD-2復合物，這導致下游介質的激活，包括NF-κB，其增加促炎分子的產生，如TNF-α、IL-1β和IL-6、趨化因子等[16]。此外，TLR4也可通過接頭蛋白髓樣分化蛋白依賴和非依賴的方式，介導細胞因子的產生、刺激樹突狀細胞的成熟，參與固有免疫反應[17]。哮喘可促進氣道嗜酸性粒細胞增多、粘液分泌過度、支氣管高反應性等，循環中高濃度IL-6的哮喘患者比沒有IL-6炎癥的患者哮喘嚴重得多，而IL-6受IL-1β的調節，因此IL-6的增加可能標志著IL-1β活性的增加，也提示哮喘病情的加重[18]。有研究發現，用TLR4抑制劑治療哮喘小鼠，可降低哮喘小鼠BALF中炎性細胞數量、肺纖維化水平和肺細胞凋亡[19]。另有研究顯示，通過抑制哮喘小鼠體內TLR4/NF-κB途徑，進而降低IL-1、IL-10、TNF-α水平，可減輕哮喘誘導的氣道炎癥和氣道重塑[20]。本研究發現，與對照組相比，模型組TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA及蛋白水平均升高。提示模型組小鼠體內TLR4/NF-κB通路紊亂，出現炎性反應。與模型組相比，低中高劑量SSd組TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA及蛋白水平均降低。上述研究表明SSd能夠降低哮喘小鼠炎癥水平可能與其抑制TLR4/NF-κB通路及其下游調控炎性因子TNF-α、IL-1β有關。

綜上所述，SSd可能具有減輕哮喘小鼠氣道炎癥水平的作用，其作用機制可能是通過調控TLR4/NF-κB通路，降低哮喘小鼠氣道炎性因子TNF-α、IL-1β水平，最終達到治療哮喘的目的。炎癥相關通路只是哮喘發生的機制之一，且上下游相關因子較多，本研究僅對TLR4/NF-κB通路及其下游因子進行分析，可能對SSd作用機制相關通路的研究不夠全面，有待后續進一步完善研究。