瑞香素通過PI3K/AKT和BMP/Smad信號通路保護糖皮質激素誘導的成骨細胞增殖和分化抑制研究

王洋 王飛 張思萌 張煉

糖皮質激素(glucocorticoids，GCs)具有抗炎和免疫抑制活性，廣泛應用于治療各種自身免疫和炎性疾病。過量或長期應用糖皮質激素會對骨骼造成多種不良影響，包括骨質疏松癥[1]。Migliaccio等[2]研究發現糖皮質激素可以抑制成骨細胞增殖和分化，是GCs誘導骨丟失過程中的重要機制。另外，Yu等[3]研究表明糖皮質激素可以通過自由基損傷來增加成骨細胞凋亡。GCs受體對于糖皮質激素引起的骨質疏松癥非常重要，敲除GCs受體可以明顯緩解糖皮質激素誘導的成骨細胞分化抑制[4,5]。目前，尚無針對糖皮質激素誘導骨質疏松癥的具體治療方法[6]。瑞香素(7，8-二羥基香豆素)是瑞香屬植物長白瑞香的主要有效成分，是我國的首創新藥，用于治療包括心絞痛、類風濕性關節炎和血栓閉塞性脈管炎在內的各種疾病[7]。瑞香素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和神經保護等多種活性作用。有研究表明，瑞香素在骨髓來源的巨噬細胞中通過抑制核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)和蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)信號通路阻斷了NF-κB配體(receptor activator of nuclear factor kappa В ligand，RANKL)介導的破骨細胞生成[8]。此外，Wu等[9]發現瑞香素可通過抑制細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)、活化T細胞的核因子胞質鈣調磷酸酶依賴性1(nuclear factor of activated T cells,cytoplasmic,calcineurin-dependent 1，NFATc1)途徑來減輕體內脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的骨溶解和RANKL介導的破骨細胞生成。本研究探討瑞香素對糖皮質激素誘導的成骨細胞增殖、分化和礦化抑制的作用，并探討瑞香素對磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K)/AKT信號和骨形態發生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)/Smad信號活化的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑 抗PI3K和p-PI3K一抗、抗AKT和p-AKT一抗、抗Smad和p-Smad抗體及GAPDH一抗均購自CST公司(美國)；地塞米松購自Sigma公司(美國)；瑞香素購自阿拉丁公司(上海)；RIPA蛋白裂解液、蛋白酶和磷酸酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒均購自碧云天生物科技公司(上海)；CCK-8試劑盒購自KeyGen生物科技公司(南京)；Trizol RNA裂解液、PCR逆轉錄試劑盒和熒光定量(qPCR)試劑盒均購自諾維贊生物科技公司(南京)；茜素紅S試劑盒購買于碧云天生物科技公司(上海)；所有引物均有上海生工合成提供。

1.2 儀器 Multiskan Sky酶標儀(賽默飛公司，美國)；StepOne型熒光定量PCR儀(賽默飛公司，美國)；PCR逆轉錄儀(Bio-Rad，美國)；全自動凝膠成像分析系統(Bio-Rad，美國)；BX53M工業正置顯微鏡(奧林巴斯，日本)。

1.3 細胞培養 小鼠MC3T3-E1細胞購自中國科學院細胞庫(上海，中國)，并用含有6%胎牛血清(FBS)和1%青霉素和鏈霉素的MEM培養基培養于37℃和5%CO2細胞培養箱。

1.4 細胞活性 將細胞(5×103個/孔)傳代培養于96孔板，將細胞分為對照組、地塞米松組和瑞香素(5、10、20、40、60和80 μmol/L)+地塞米松組。24 h后，對照組用無血清培養基處理，地塞米松組用地塞米松(1 μmol/L)處理，瑞香素(5、10、20、40、60和80 μmol/L)+地塞米松組用不同濃度的瑞香素和地塞米松處理。5 d后，采用CCK-8試劑盒評價細胞活力，并用酶標儀測量450 nm處的吸光度。

1.5 細胞礦化度測量 將細胞分為對照組、地塞米松組、瑞香素(40、60和80 μmol/L)+地塞米松組，將細胞與地塞米松孵育或與地塞米松和瑞香素共同孵育14 d，用PBS洗滌細胞2次，并用70%乙醇固定10 min。然后，將細胞與0.5%茜素紅S(pH值4.1)于室溫下孵育10 min。橙紅色表示鈣沉積的位置和強度，為了量化茜素紅S染色，向每個孔加入10%氯化十六烷基吡啶(CPC)，并孵育30 min，應用酶標儀于550 nm測定吸光度。

1.6 蛋白免疫印跡 根據上述分組處理細胞，然后用含有磷酸酶和蛋白酶抑制劑的預冷RIPA裂解液于4℃裂解30 min。然后，10 000 r/min于4℃下離心15 min，收集上清。用BCA蛋白試劑盒確定蛋白濃度，加入Loading buffer液于100℃煮10 min。將30 μg總蛋白的細胞裂解液進行SDS/PAGE電泳，然后將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用抗體稀釋液稀釋一抗，與膜孵育4℃過夜，然后用HRP標記的二抗室溫孵育120 min，最后用增強的化學發光試劑顯色，并用Image J灰度掃描分析數據，GAPDH作為蛋白內參。

1.7 熒光定量PCR 按照上述分組處理細胞，根據制造商的說明，使用Trizol試劑提取細胞總RNA。根據制造商方法使用逆轉錄試劑盒合成cDNA，加入SYBR染料qPCR，用Stepone儀器進行數據收集。PCR擴增條件：95℃持續2 min，然后45個循環(95℃持續15 s)和60℃持續60 s，GAPDH用作內參對照，通過2-ΔΔCt法計算基因表達。引物序列如下，ALP：Forward 5’-ATCTTTGGTCTGGCTCCCATG-3’，Reverse 5’-TTTCCCGTTCACCGTCCAC-3’；OCN：Forward 5’-CTCCCATTGGCGAGTTTG-3’，Reverse 5’-TGTAGTCCAGGTGGAGCTTGTG-3’；COLL-1：Forward 5’-ACCTCCCAGTGGCGGTTATGAC-3’，Reverse 5’-AGTTCTTCTGAGGCACAGACGG-3’；Runx2：Forward 5’-TTTGCAGTGGGACCGACA-3’，Reverse 5’-AGCCATGGTGCCCGTTAG-3’； GAPDH：Forward 5’-AGAAAAACCTGCCAAATATGATGAC-3’，Reverse 5’-TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC-3’。

2 結果

2.1 MC3T3-E1細胞活力變化 與對照組比較，地塞米松組的細胞活力明顯減小(P<0.05)；與地塞米松組比較，用不同濃度的瑞香素(5 μmol/L，10 μmol/L，20 μmol/L，40 μmol/L，60 μmol/L和80 μmol/L)和地塞米松共同培養呈劑量依賴性增加細胞活力，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 MC3T3-E1細胞成骨分化變化 與對照組比較，地塞米松組細胞中ALP、OCN、COLL1和Runx2的表達量明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)；與地塞米松組比較，地塞米松+瑞香素40 μmol/L組、60 μmol/L組和80 μmol/L組細胞中ALP、OCN、COLL1和Runx2的表達量呈劑量依賴性增加，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 細胞活力變化

表2 細胞中mRNA相對表達變化量

2.3 MC3T3-E1細胞礦化變化結果 與對照組比較，地塞米松組細胞的茜素紅S染色明顯減弱，差異具有統計學意義(P<0.05)；相較于地塞米松組，瑞香素40 μmol/L，60 μmol/L和80 μmol/L組細胞中茜素紅S染色呈劑量依賴性加深，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1，表3。

表3 細胞礦化變化結果

2.4 MC3T3-E1細胞BMP/Smad蛋白表達變化結果 與對照組比較，地塞米松組細胞中p-Smad/Smad蛋白相對表達量明顯減小，差異有統計學意義(P<0.05)；相較于地塞米松組，瑞香素40 μmol/L，60 μmol/L和80 μmol/L組細胞中p-Smad/Smad蛋白相對表達量明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2，表4。

2.5 MC3T3-E1細胞PI3K/AKT蛋白表達變化結果 與對照組比較，地塞米松組細胞中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT蛋白相對表達量明顯減小，差異有統計學意義(P<0.05)；相較于地塞米松組，瑞香素40 μmol/L，60 μmol/L和80 μmol/L組細胞中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT蛋白相對表達量明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3，表5。

圖2 瑞香素對MC3T3-E1細胞BMP/Smad蛋白表達的影響

表4 細胞中Smad蛋白相對表達變化量

3 討論

骨質疏松癥是一種全身性骨代謝疾病，表現為骨量、骨強度和骨微結構受損，最終引起骨折風險增加，嚴重影響了人們的日常活動和生活質量。糖皮質激素是甾體抗炎藥，具有抗炎和免疫抑制活性，廣泛用于多種炎性和自身免疫性疾病[10]。但糖皮質激素長時間應用可能導致不良反應，包括骨質疏松癥。糖皮質激素誘發的骨質疏松癥(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)是繼發性骨質疏松癥的最常見形式。目前，臨床無確定的治療方法，因此，迫切需要開發治療糖皮質激素誘發型骨質疏松癥的藥物。

圖3 瑞香素對MC3T3-E1細胞PI3K/AKT蛋白表達的影響

表5 細胞中PI3K/AKT蛋白相對表達變化量

地塞米松是一種合成的糖皮質激素，在臨床實踐中被廣泛使用，并具有抑制骨形成的作用。糖皮質激素長期治療可導致礦物質密度降低，并可通過抑制成骨細胞分化干擾骨骼形成。高劑量的地塞米松(1 μmol/L)可以顯著抑制成骨細胞的成骨分化和礦化能力[11,12]。抑制成骨細胞的增殖和分化被認為是糖皮質激素誘導骨丟失的關鍵因素[2,6]。本研究觀察到1 μmol/L地塞米松可以明顯抑制MC3T3-E1細胞的活性，抑制成骨細胞增殖，但不同濃度的瑞香素(10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L和80 μmol/L)呈劑量依賴性緩解了地塞米松誘導細胞增殖抑制。另外，成骨細胞礦化是骨發育和骨代謝的重要步驟，本研究也探討了瑞香素對成骨細胞礦化的影響，發現瑞香素可以明顯促進成骨細胞礦化。

有研究發現瑞香素可以緩解骨質疏松癥，并明顯促進了Runx2表達，Runx2是RUNXX家族的成員之一，作為成骨細胞特異的轉錄因子，對成骨細胞的分化和成熟具有重要作用[13,14]。Runx2基因敲除在小鼠體內生長過程中可以誘導體內骨骼完全喪失[15,16]。Runx2與成骨細胞的主要細胞外基質基因的表達密切相關，如堿性磷酸酶(ALP)，骨鈣素(osteocalcin，OCN)，Ⅰ型膠原(type Ⅰ collagen，COLL-1)，骨唾液蛋白(bone sialoprotein，BSP)和骨橋蛋白(osteopontin，OPN)[17,18]。本研究發現地塞米松可以明顯抑制成骨細胞中ALP、OCN和COLL-1的表達，但瑞香素可以明顯促進ALP、OCN和COLL-1的表達。ALP是早期成骨細胞成熟標志，其水平可以明顯反映成骨細胞分化水平，并與骨礦化密切相關。OCN是一種成骨細胞分泌蛋白，反映了成骨細胞功能，且COLL-1是骨基質的主要纖維膠原成分，與骨代謝密切相關。這些說明瑞香素對地塞米松誘導的成骨細胞增殖、分化和礦化抑制均具有保護作用。

成骨細胞介導的骨形成與破骨細胞介導的骨吸收維持了機體的骨穩態過程[19]。骨形成受到各種合成代謝信號分子的調節，包括PI3K/Akt，MAPK，Wnt/β-catenin和BMP/Smad，這些信號可以誘導關鍵成骨轉錄因子如Runx2的表達[20,21]。ERK信號成骨分化過程中激活，ERK磷酸化并激活了Runx2，從而促進成骨細胞分化。GC也可以通過抑制ERK信號激活，并阻斷了Runx2介導的成骨細胞分化。BMP/Smad信號的激活通過Smad1/5/9的激活誘導Runx2表達，Runx2誘導成骨細胞分化[22]。PI3K/Akt信號傳導在許多細胞活動中發揮重要作用，如細胞生長、增殖和存活[23]。最近的報道表明，PI3K/Akt信號通路對成骨細胞的分化和增殖具有重要作用[24]。Akt可以促進BMPs誘導的成骨細胞分化，并增強Runx2的功能和轉錄活性[25]。本研究也發現瑞香素可以促進成骨細胞Runx2表達，減弱了地塞米松誘導的MC3T3-E1細胞分化和礦化抑制。與之前研究一致，地塞米松明顯抑制了成骨細胞PI3K/Akt和BMP/Smad信號表達[26]。BMP/Smad信號在成骨細胞分化后期的進一步分化和成熟中起主導作用[27]。但是，PI3K/AKT信號和BMP/Smad信號之間是否存在相互作用，尚不清楚。本研究發現瑞香素可以激活地塞米松誘導的PI3K/AKT信號和BMP/Smad信號抑制。

綜上所述，本研究發現地塞米松明顯抑制了成骨細胞增殖、分化和礦化，并抑制了PI3K/AKT和BMP/Smad信號活化。同時瑞香素促進了地塞米松誘導成骨細胞增殖、分化和礦化抑制，并激活了PI3K/AKT和BMP/Smad通路。說明瑞香素可以作為糖皮質激素誘導性骨質疏松癥的先導化合物，但瑞香素的抗骨質疏松癥活性和其他分子機制仍需進一步探討。