子宮內膜息肉中腫瘤壞死因子-α和環氧合酶-2的表達水平

肖艷來 張麗 張藝瑋 王若晰 王健

子宮內膜息肉(endometrial polyp，EP)是常見的婦科疾病，通常包括子宮內膜腺體、間質以及血管，病灶可以是單一性的，也可是多發性的，且病灶的直徑存在差異性[1]。通常可導致子宮異常出血及不孕等，但也可無癥狀。各個年齡層的女性均可發病，以絕經后女性發病率最高[2]。EP是良性腫瘤，但一些EP可能是癌前病變甚至是癌癥[3]。隨著婦科超聲及宮腔鏡等技術的發展，子宮內膜息肉的診斷和治療水平已經有了極大的提高，但目前其發病機制和病因仍不清楚。近年來中外大量的研究結果顯示，多種因素的共同作用導致了息肉的發生[4,5]。本研究通過觀察絕經后女性子宮內膜息肉、息肉周圍內膜組織和宮腔內遠離息肉內膜組中 TNF-α和COX-2的表達情況，并分析研究炎性因子TNF-α與COX-2的相關性，探討子宮內膜息肉可能的發生機制，以期為臨床工作提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至2020年10月在河北醫科大學第三醫院婦科就診，因異常子宮出血或宮腔占位行宮腔鏡檢查的患者，將接受宮腔鏡檢查且病理證實為子宮內膜息肉者30例患者作為研究對象，根據取材部位不同將其分為息肉組、息肉周圍內膜組、宮腔內遠離息肉內膜組。排除標準：以上各組患者治療前3個月未應用激素及抗組胺等藥物，未合并感染性疾病及其他惡性腫瘤病史。所有入組患者簽署相關知情同意，且本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 方法 宮腔鏡直視下用活檢鉗鉗取息肉組織或宮腔鏡下電切息肉組織、息肉周圍內膜組織和宮腔內遠離息肉內膜。術中獲取的組織標本放入液氮中保存。

1.3 試劑與主要儀器 COX-2(#12282，兔單抗)、TNF-α(#6 945，兔單抗)、β-Actin(#3700，兔單抗)抗體購自美國Cell Signaling Technology，HRP偶聯山羊抗鼠(ab6 789)、山羊抗兔多克隆二抗(ab97051)購自美國Abcam。組織蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL發光試劑盒購自美國Thermo。總RNA提取試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司，反轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒購自莫納生物科技有限公司，引物由美國Invitrogen生命技術有限公司合成、ELISA試劑盒購自酶免試劑盒。

1.4 蛋白印記 0.2 g組織中加入1 ml蛋白提取用組織裂解液，在研缽中研碎組織后將其轉移到EP管中，置于4 ℃振蕩器上振蕩裂解10 min，12 000×g 4℃離心10 min。吸取上清液置于新EP管中，并用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度，所剩蛋白樣品按量加入蛋白上樣緩沖液，混勻后置于100°C沸水中加熱5 min，樣品可直接用于Western blot實驗及SDS-PAGE，用5%牛奶封閉PVDF膜，加入相應一抗(1∶1 000)及二抗(1∶5 000)，并用ECL發光試劑盒檢測相應分子的表達量，并利用Image J軟件計算灰度值。以目標蛋白與內參蛋白的吸光度比值表示蛋白的相對表達量。

1.5 RT-PCR

1.5.1 組織標本提取細胞總RNA：方法嚴格按照武漢賽維爾RNA提取液說明書執行。

1.5.2 反轉錄反應：嚴格按照莫納試劑盒說明書進行操作。

1.5.3 引物由invitrogen公司合成如下：引物序列COX-2F:5′-TTC AAA TGA GAT TGT GGA AAA AT -3′,R:5′-AGA TCA TCT CTG CCT GAG TAT CTT -3′,GAPDHF:5′-AAG GTC GGA GTC AAC GGA TTT -3′,R:5′-AGA TGA TGA CCC TTT TGG CTC -3′,qPCR反應程序以 cDNA 為模板行qPCR，分別擴增COX -2 和 GAPDHCOX-2 循環條件:預變性 95℃ 5 min; 變性95℃ 10 s,退火60℃ 10 s,延伸72℃ 30 s,共計40個循環。GAPDH 循環條件:預變性 95℃ 5 min; 變性95℃ 10 s,退火55℃ 10 s,延伸72℃ 30 s,共計30個循環。采用GAPDH作為內參，以2-ΔΔCt計算所得值作為目的mRNA的相對定量。

1.6 ELISA 嚴格依照酶免試劑盒操作說明檢測TNF-α。

2 結果

2.1 TNF-α和COX-2在子宮內膜息肉組織、息肉周圍組織和遠離息肉組織中的表達 TNF-α和COX-2在子宮內膜息肉組織、息肉周圍組織和遠離息肉組織中均有不同程度的表達。

2.1.1 TNF-α在30例子宮內膜息肉組織中強陽性表達28例，陽性表達率93.3%(28/30)；30例息肉周圍組織中強陽性表達12例，陽性表達率40.0%(12/40)；30例遠離息肉組織中強陽性表達2例，陽性表達率6.7%(2/30)。TNF-α在子宮內膜息肉組織中的表達高于息肉周圍組織和遠離息肉組織，TNF-α在息肉周圍組織中的表達高于遠離息肉組織，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 Western blot實驗檢測TNF-α和COX-2在3組中的表達

2.1.2 COX-2在30例子宮內膜息肉組織中強陽性表達27例，陽性表達率90.0%(27/30)；30例息肉周圍組織中強陽性表達15例，陽性表達率50.0%(15/30)；30例遠離息肉組織中強陽性表達3例，陽性表達率10.0%(3/30)；COX-2在子宮內膜息肉組織的表達高于其在息肉周圍組織和遠離息肉組織的表達，COX-2在息肉周圍組織中的表達高于遠離息肉組織，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1，表1。

表1 TNF-α和COX-2在3組中的強陽性表達 n=30，例(%)

2.2 COX-2 mRNA在子宮內膜息肉組織、息肉周圍組織和遠離息肉組織中的表達 COX-2 mRNA在子宮內膜息肉組織中的表達高于息肉周圍組織和遠離息肉組織，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3 TNF-α在子宮內膜息肉組織、息肉周圍組織和遠離息肉組織中的表達 TNF-α在子宮內膜息肉組織中的表達高于息肉周圍組織和遠離息肉組織，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 COX-2 mRNA在子宮內膜息肉組織、息肉周圍組織和遠離息肉組織中的表達

表3 TNF-α在子宮內膜息肉組織、息肉周圍組織和遠離息肉組織中的表達

2.4 TNF-α與COX-2表達的關系 TNF-α在30例子宮內膜息肉組織中強陽性表達28例，COX-2強陽性表達25例；COX-2在30例子宮內膜息肉組織中強陽性表達27例，TNF-α陽性表達25例；呈負相關(rs=-0.516，P=0.001)。見表4。

表4 TNF-α與COX-2表達的相關性 例

3 討論

子宮內膜息肉是婦科常見病之一，宮內膜局部組織受某種因素的影響，過度增生形成一種良性腫物。月經量增多、經期改變、異常子宮出血、絕經后陰道流血及不孕等臨床癥狀都可由其導致。

COX又稱前列腺素過氧化物合成酶，是前列腺素合成過程中一個重要的限速酶，機體的多種病理生理過程中，如炎性反應、發熱、出凝血機制等均有其參與。COX至少包含兩種同工酶，即COX-1和COX-2。普遍認為，COX-1介導了生理過程，而COX-2則參與了病理過程的介導。研究發現，在正常組織中COX-2幾乎不表達，而在炎癥等的發生發展中可見其表達痕跡[6]，且已被證實在大腸和胃黏膜息肉的發展中起關鍵作用[7]，例如COX-2在50%的結腸腺瘤和90%的大腸癌中表達，在大腸腫瘤中具有促進生長的特性[8]。COX-2促進細胞增殖、腫瘤進展和新血管生成的能力不僅限于結直腸腫瘤，而且在包括子宮內膜癌在內的其他腫瘤中也已觀察到，在這些腫瘤中，微血管密度和浸潤傾向受COX-2表達水平的影響[9]。腫瘤的分級和侵襲性均與COX-2水平也呈正相關[10]。在子宮內膜中，COX-2的活性受月經周期階段的影響，在黃體期后期(腺體增殖為零時)會大大降低[11]。在子宮內膜增生中也已檢測到COX-2表達，提示前列腺素在其發病機制中的可能作用，但是目前機制尚不明確[12]。促炎細胞因子中的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是一種細胞因子，其具有多種生物學功能，可介導多種細胞因子、生長因子及其受體基因的表達，在機體的炎性反應、免疫反應、抗腫瘤作用及細胞凋亡等程序中均有參與，其在炎性反應過程中最早出現，同時也是最重要的炎性介質[13]。它不但能刺激巨噬細胞、上皮細胞等分泌細胞因子及花生四烯酸代謝物等，而且還能吞噬細胞產物和補體片段，從而使得間質中蛋白質水腫、破壞、細胞壞死。TNF-α通過調節血管生成，促進子宮內膜間質細胞增生和炎性因子的產生[14]。子宮內膜息肉中COX-2活性和TNF-α表達是否相關尚不明確。

關于子宮內膜息肉的形成機制，目前尚不明確，但主要學說有以下幾種：(1)炎癥刺激學說：通過研究發現具有宮內節育器、子宮內膜炎、子宮內膜結核的女性，其發生子宮內膜息肉的概率高于正常女性，因此，可以認為是長期的機械刺激和/或炎性因子的刺激致使子宮內膜增生，從而產生子宮內膜息肉。(2)激素刺激學說：Taylor等[15]研究分泌期以及增生期子宮內膜息肉組織得出促使子宮內膜息肉形成的原因可能與ER高表達，PR低表達相關。(3)細胞凋亡/增殖失衡學說：Maia等[16]研究表明，在子宮內膜息肉組織中，月經增殖期Ki67、Bcl-2、p53 的表達要高于黃體期的表達，由此考慮子宮內膜息肉與增生和分化程序失調有關。(4)蛋白表達異常學說：Erdemoglu等[17]研究表明，在絕經前后患者的子宮內膜息肉組織中，COX-2、MMP-2和MMP-9均可被檢測到，且其在絕經前息肉組織間質中表達要高于絕經后息肉組織。(5)細胞因子學說：Xuebing等[18]發現，在息肉組織腺上皮中血管內皮生長因子的含量高于其在周圍內膜組織的含量。靳閃閃[19]研究表明內皮擬素ENS在息肉組織中的表達呈高水平，并且與VEGF表達呈正相關。(6)遺傳因素：Dal Cin等[3]通過對良性子宮內膜息肉的研究表明57%的患者有常染色體重組現象，Vanni等[20]認為，子宮內膜息肉組織中異常改變的主要基因位點為 t(6;14)(p21;q24)。(7)其他：服用激素類藥物、肥胖、妊娠次數等也與子宮內膜息肉的發生有關。總之，其發病并不是由單一因素導致，而是由炎癥、細胞凋亡、免疫逃逸、內分泌失衡等因素共同導致[21]，宮腔內炎癥導致內膜息肉的發生最早被提出，宮腔鏡下可見基質水腫、腺體周圍充血、內膜增厚等炎性反應，但炎癥導致EP發生的機制并不明確。且有研究發現，炎性細胞、致炎因子等諸多途徑還可促進腫瘤的發生及發展。

本研究發現在已知患有子宮內膜息肉的女性人群中，子宮內膜腔中TNF-α和COX-2的表達水平升高，并且兩者具有相關性。先前的觀察表明，雌激素可以有效地增加人子宮微血管內皮細胞中的COX-2 mRNA和蛋白質水平[22]。前列腺素參與細胞增殖和腫瘤進展，并且COX-2對于調節該過程至關重要。事實證明，使用選擇性COX-2抑制劑可有效治療和預防結直腸息肉[23]。根據我們在這里報道的數據，子宮內膜息肉中COX-2的存在可能暗示COX-2在子宮內膜息肉生長中的作用類似于結腸息肉中這種酶的作用[8]。

眾所周知，子宮的某些紊亂會產生子宮內膜環境的改變，與子宮內避孕藥具相關的子宮變化似乎導致IL-1b、TNF-α和IL-6升高。但是，無論子宮組成改變的原因如何，無論子宮內膜環境如何變化，都可能影響成功受孕的可能性。例如，據報道IL-1、TNF-α和IFN-g在高濃度下對胚胎發育和植入具有有害作用[24]。同樣，這些細胞因子也參與了無法解釋的反復流產[25]。在本研究中，發現絕經期子宮內膜息肉患者息肉中TNF-α和COX-2的表達呈相關性。TNF-α可通過趨化EOS聚集或誘導COX-2的表達，調控前列腺素分泌，從而加重炎性反應。TNF-α還能快速誘導EOS中P38磷酸化，從而誘導COX-2的產生，產生一系列病理反應[26]。

綜上所述，子宮內膜息肉目前尚未明確發病機制，可能與炎癥刺激、細胞增殖/凋亡失衡、局部血管生成異常等多種因素有關。本研究結果表明，患者的息肉組織相比于正常內膜組織，TNF-α和COX-2表達升高，并具有相關性，進一步驗證了子宮內膜息肉的發生發展是多因素共同作用的結果；同時這也是臨床上單一藥物治療后容易復發的原因，這也為該疾病需要綜合的臨床治療提高了理論依據。