葒草苷調控PI3K/Akt通路對腦缺血再灌注大鼠腦組織線粒體自噬的影響

杜靜 賈冬雪 王書華

全球疾病負擔統計表明，我國腦卒中發病率高達39.9%，全球排名第一[1]。急性缺血性腦卒中目前最有效治療方法之一為血管介入再通，而部分大血管開通后再灌注導致神經功能進一步惡化[2]，因此探索尋找保護缺血再灌注腦組織損傷的相關藥物成為目前臨床科研工作者一個研究熱點。葒草苷是中藥金蓮花中的主要有效活性成分之一，課題組已成功從金蓮花中提取出葒草苷，經證實其純度達98.8%[3]，兔體內藥代動力學研究表明葒草苷在腎、肝、腦等組織中均有分布，分布與消除較快，不易產生蓄積中毒[4]。團隊既往研究表明葒草苷調控JNK/ERK通路抑制自噬過度激活對腦缺血再灌注大鼠腦組織的保護[5]，而PI3K/Akt 信號通路是腦缺血再灌注損傷及自噬調控的重要通路，本實驗進一步探討葒草苷是否通過激活PI3K/Akt信號通路抑制線粒體自噬過度激活從而保護缺血再灌注大鼠腦組織，為葒草苷用于臨床研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：SPF級健康雄性SD大鼠，購自北京斯貝福生物科技有限公司，體重250～280 g，許可證號SCXK (京) 2019-0010，購進實驗室后于溫度(24±2)℃，濕度(50±2)%的條件下按照自然節律飼養，正常飲食標準適應性喂養1周后，選取體重和狀態合格的大鼠進行后續實驗。

1.1.2 藥品與試劑：葒草苷(自制，純度98.8%)；LY294002(70920)，購自Cayman公司；自噬微管相關蛋白輕鏈3(LC3)抗體(PM036)，日本MBL公司生產；Bcl-2/E1B-19 K相互作用蛋白3(BNIP3)抗體(A19593)，磷酸化Akt抗體(AP0140)，Akt抗體(A11016)，均購自ABclonal公司。

1.1.3 儀器：電泳儀，美國Bio-Rad 公司；FM0530多色熒光和化學發光成像系統，ProteinSimple公司；Sigma 3K30型超速冷凍離心機，德國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物配制

1.2.1.1 葒草苷溶液：葒草苷用N,N-二甲基甲酰胺(dimethylsulfoxide,DMF)溶解，加入吐溫-80助溶，最后加入0.9%氯化鈉溶液稀釋(DMF∶吐溫-80∶0.9%氯化鈉溶液=1∶1∶20)，配制成6.48 μmol/kg溶液。

1.2.1.2 LY294002溶液：將LY294002粉末溶解于DMSO和吐溫-80(DMSO∶吐溫-80=1∶1)中，加入0.9%氯化鈉溶液稀釋，配制成2.60 mg/ml的LY294002溶液。

1.2.2 大鼠腦缺血再灌注模型制備：采用改良線栓法制備MCAO模型,大鼠禁食不禁水12 h后腹腔注射7%水合氯醛(350 mg/kg)深度麻醉，仰臥固定于手術臺上，于頸部正中位置用直剪做縱向切口，鈍性分離組織，暴露右側頸總動脈，小心分離頸總動脈和迷走神經，并向上分離出頸內動脈和頸外動脈，結扎頸總動脈近心端和頸外動脈，夾閉頸內動脈，在頸總動脈距分叉4 mm處剪1小孔，將栓線包有硅膠一端小心從開口處插入，沿頸內動脈緩慢推進18～20 mm，遇到阻力即停，表明栓線硅膠膨大處已阻塞大腦中動脈，將栓線固定好。缺血2 h后，小心緩慢地拔出栓線(拔線時為避免掙扎對血管造成損傷大鼠一直處于麻醉狀態)，制備MCAO模型完畢。假手術組大鼠只分離血管，不插入栓線。

1.2.3 分組與給藥：將造模成功的大鼠隨機分為I/R組、葒草苷組、葒草苷+LY294002組、LY294002組，假手術組作對照組，每組8只。葒草苷給藥組分別于術后1 h和12 h腹腔注射6.48 μmol/kg葒草苷溶液2次，葒草苷+LY294002組和LY294002組分別于術前24 h和0.5 h給予2.60 mg/ml LY294002溶液2次，假手術組和I/R組給予同等劑量的溶劑+ 0.9%氯化鈉混合溶液。

1.2.4 神經功能缺損評分：再灌注24 h后，按照Zea Longa建立的評分法對各組大鼠進行神經功能損傷評分，通過觀察雙側肢體肌力大小、大鼠肢體動作的協調性以及探索能力，對腦缺血再灌注損傷大鼠的神經功能損傷程度做直觀評估，分數越高，神經功能損傷越嚴重。0分：大鼠肢體運動正常，無明顯行為學改變；1分：大鼠左前爪蜷曲，不能完全舒展；2分：大鼠左側抗側推能力明顯減弱，肩內收，走路時向左側轉圈；3分：行走時向左側傾斜搖擺不定；4分：意識模糊，不能自發行走。

1.2.5 大鼠腦梗死體積測定：再灌注24 h后，5組大鼠深度麻醉取腦，預冷0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，-20℃冷凍20 min，對腦組織等距冠狀切片，每片厚度約2 mm，放入配好的2%TTC染液中于37℃溫箱中染色15 min，每5分鐘翻動1次以保證腦組織均勻染色，將腦片放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，其中紅色部分為正常組織，白色部分為梗死組織。濾紙吸干水分拍照，用Image J軟件分析圖片，為排除腦水腫對腦梗死體積測定的影響，采用校正后的計算公式計算腦梗死體積百分比：腦梗死體積百分比=(缺血對側正常腦組織體積-缺血側正常腦組織體積)/缺血對側正常腦組織體積×100%。

1.2.6 半球腫脹的測定：針對TTC染色圖片，應用Image J分析軟件分析計算各組大鼠的半球腫脹。具體計算公式如下：腦半球腫脹百分比=(缺血側體積-缺血對側體積)/缺血對側體積×100%。

1.2.7 大鼠腦組織線粒體蛋白和胞漿蛋白提取：從-80℃冰箱取出凍存腦組織約100 mg，精準稱重后剪碎，按比例加入含有1% PMSF和1%磷酸酶抑制劑的線粒體分離液A(組織：線粒體分離液A=1∶10)，放入玻璃勻漿器中制備成勻漿液，于4℃，600 g條件下離心5 min，小心轉移上清液至另一離心管，于4 ℃，11 000 g條件下離心10 min，沉淀即為線粒體。此步驟收集上清液于4℃，12 000 g離心10 min，上清液即為去除線粒體的細胞漿蛋白。在線粒體沉淀中加入含有1% PMSF的線粒體裂解液(組織：裂解液=1∶2)，渦旋混勻，冰浴上反應20 min，每5分鐘渦旋混勻一次保證線粒體可充分裂解，裂解液于12 000 r，4℃條件下離心10 min，上清即為所需的線粒體蛋白。

1.2.8 Western blot檢測大鼠腦組織線粒體中BNIP3、LC3蛋白和胞漿中Akt、p-Akt蛋白的表達：BCA法測定蛋白濃度后金屬浴變性制備上樣樣品，線粒體蛋白以COX Ⅳ為內參，胞漿蛋白以β-actin為內參，通過計算目標蛋白和內參的比值反應各組蛋白的表達水平。

2 結果

2.1 葒草苷對大鼠神經功能損傷評分的影響 假手術組大鼠肢體運動無明顯改變，評分為0分；與假手術組比較，I/R組大鼠出現明顯肢體運動障礙，神經功能評分顯著升高(P<0.01)；與I/R組比較，葒草苷治療后大鼠神經功能明顯改善，評分明顯降低(P<0.01)；與葒草苷組比較，葒草苷+LY294002處理組大鼠神經功能損傷評分升高(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠神經功能缺損評分、腦梗死體積及半球腫脹程度

2.2 葒草苷對大鼠腦梗死體積的影響 與假手術組比較，I/R組大鼠腦梗死體積顯著增加(P<0.01)；與I/R組比較，葒草苷處理組大鼠腦梗死體積明顯降低(P<0.01)；與葒草苷組比較，葒草苷+LY294002處理組大鼠腦梗死體積顯著增加(P<0.05)。見表1，圖1。

圖1 葒草苷和 LY294002對大鼠腦梗死體積的影響

2.3 葒草苷對大鼠腦半球腫脹的影響 與假手術組比較，I/R組大鼠腦組織半球腫脹百分比明顯增加(P<0.01)；與I/R組比較，葒草苷給藥組大鼠腦半球腫脹百分比明顯降低(P<0.01)；與葒草苷組比較，葒草苷+LY294002處理組大鼠腦半球腫脹百分比明顯增加(P<0.05)。見表1，圖1。

2.4 葒草苷對大鼠腦組織線粒體中LC3、BNIP3蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，與假手術組比較，I/R組大鼠腦組織線粒體中LC3和BNIP3蛋白相對表達量顯著增加(P<0.01)；與I/R組比較，葒草苷處理組大鼠腦組織線粒體中LC3和BNIP3蛋白的表達顯著降低(P<0.05)；抑制劑LY294002處理組大鼠腦組織線粒體中LC3和BNIP3蛋白的表達顯著增加(P<0.05)；與葒草苷組比較，葒草苷+LY294002能明顯增加大鼠腦組織線粒體中LC3和BNIP3蛋白的相對表達(P<0.05)。見表2，圖2。

表2 5組大鼠腦組織粒體中 LC3、BNIP3 蛋白及胞漿中 p-Akt 蛋白表達水平

圖2 葒草苷和 LY294002對大鼠線粒體自噬的影響

2.5 葒草苷對大鼠腦組織胞漿中p-Akt蛋白表達的影響 以β-actin為內參，通過p-Akt/Akt的比值來反映p-Akt的表達情況。Western blot結果顯示，I/R組大鼠腦組織胞漿中p-Akt的相對表達量遠低于假手術組(P<0.01)；與I/R組比較，給予葒草苷治療后p-Akt相對表達量顯著升高(P<0.01)，LY294002處理組p-Akt蛋白的相對表達水平降低(P<0.05)；與葒草苷組比較，葒草苷+LY294002能夠明顯降低p-Akt蛋白的相對表達水平(P<0.05)。見表2，圖3。

圖3 葒草苷對大鼠PI3K/Akt信號通路的影響

3 討論

腦缺血再灌注損傷是目前臨床治療缺血性腦卒中過程中發生率很高的一種并發癥[6,7]。腦缺血再灌注損傷的主要病理表現是出現腦梗死灶，腦梗死主要是血液供應不足導致缺血核心區發生不可逆壞死，以及核心區周圍的短時間血液供應不足導致的缺血半暗帶組織，此區域的組織若不能及時救治最終也會發展成不可逆壞死組織[8]。TTC可與正常腦組織中的脫氫酶反應呈現紅色，梗死組織因脫氫酶失活無法與TTC結合而呈現白色，通常采用TTC染色法測定腦梗死體積。本研究結果顯示葒草苷能明顯降低大鼠腦梗死體積和神經功能損傷評分以及半球腫脹百分比，說明葒草苷可有效減輕腦缺血再灌注大鼠腦組織損傷，與王曉茹等[9]的研究結果一致。

線粒體自噬是機體應對外界刺激的重要防御機制之一，通過有效清除受損的線粒體從而保證細胞內環境穩定。但也有研究發現線粒體自噬過度激活會破壞細胞內線粒體穩態平衡，誘導細胞自噬性死亡，加重腦組織損傷[10]。PI3K/Akt信號通路調控線粒體自噬：PI3K通過磷脂將損傷信號轉化為細胞內信息，進而刺激Akt磷酸化調控下游mTOR通路，抑制自噬過度激活[11]。LC3存在于自噬體和溶酶體膜上，自噬激活的標志為LC3-Ⅰ轉為LC3-Ⅱ。BNIP3是存在于線粒體外膜的一種蛋白，其包含的LIR結構域與LC3相互作用，誘導線粒體自噬發生[12]。因此常用LC3、BNIP3蛋白水平高低來反應線粒體自噬水平。研究結果顯示腦缺血再灌注大鼠腦組織中p-Akt的相對表達量較假手術組降低，葒草苷處理后p-Akt蛋白的相對表達水平明顯升高，LC3和BNIP3蛋白的相對表達水平明顯降低，表明葒草苷可激活大鼠腦組織中PI3K/Akt信號通路以及抑制線粒體自噬過度激活。與葒草苷組比較，提前給予LY294002干預能明顯降低大鼠p-Akt蛋白的相對表達量，而LC3和BNIP3蛋白的相對表達水平明顯升高，葒草苷對大鼠的腦保護作用也明顯減弱，說明葒草苷可能是通過激活PI3K/Akt信號通路抑制線粒體自噬過度激活對腦缺血再灌注大鼠發揮神經保護作用。Yan等[13]研究也證實激活神經元中PI3K/Akt信號通路可抑制腦缺血誘導的神經元自噬。

綜上所述，激活PI3K/Akt信號通路來抑制大鼠腦組織線粒體自噬過度激活可能是葒草苷發揮腦保護作用的另一個作用機制。