生物有機肥對鹽堿地水稻葉片的影響轉錄組分析

劉 鵬,畢江濤,李文兵,惠治兵,肖國舉,孫 權,王 靜

1 寧夏大學農學院, 銀川 750021

2 寧夏大學生態環境學院, 銀川 750021

鹽漬土又稱鹽堿土是鹽土和堿土以及不同程度鹽化和堿化土壤的統稱[1],嚴重影響植物生長發育和農業生產力的發展[2—3]。鹽脅迫會導致植物體內產生滲透脅迫和離子毒害作用,間接影響植物的光合作用、能量代謝、膜透性和生長發育[4]。水稻是我國四大主糧之一,種植水稻是生物改良鹽堿地的一種有效途徑[5],但在鹽堿脅迫下水稻整個生育周期性狀都會受到影響,葉片逐漸變短、變小,顏色隨之變淺[6],植株生物量和分蘗能力下降,產量降低[7—8]。隨著人口不斷增加,耕地面積逐漸減少,開發利用鹽堿地對增加耕地資源,改善生態環境具有重要意義[9—10]。

鹽堿地修復改良方法主要為水利工程、化學、生物等措施[11],生物修復包括植物和微生物修復,具有投入低、修復效果好、生態效益高等優點[12—13]。生物有機肥在鹽堿地修復改良中發揮著重要的作用,既能作為傳統有機肥增加土壤有機質和養分、改善物理結構[14—16],又能外源輸入有益微生物,調節土壤微生物群落結構,抑制病蟲害[17—18],改善作物水分狀況、膜完整性和光合作用[19],還可以減輕作物鹽堿脅迫、提高作物產量及品質[20—22],減輕化肥過量使用造成的環境污染[23]。

高通量RNA-Seq技術作為揭示植物響應鹽脅迫分子機制的重要手段,已取得了多項重要成果。張麗麗和張富春研究發現[24],鹽生植物鹽穗木(Halostachyscaspica)能夠通過促進滲透調節和活性氧清除,提高短期鹽脅迫適應能力；董明等[25]研究結果表明,高粱在鹽脅迫下光合作用受到抑制,激素信號和類黃酮的合成在響應鹽脅迫中發揮著重要作用；在水稻響應鹽脅迫中,翻譯調控[26]、脫落酸和油菜素甾醇等植物激素信號[27—29]、酚類和類黃酮物質合成[30]、Ca2+信號轉導、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯、轉錄因子(TFs)、轉錄調節因子(TRs)、蛋白激酶(PKs)和其他關鍵功能蛋白起著重要作用[31]。

施用生物有機肥能有效修復改良鹽堿地、改善水稻農藝性狀[32],但在基因表達水平上知之甚少。本研究采用轉錄組測序技術,對生物有機肥不同處理下水稻葉片差異基因進行GO和KEGG富集分析,功能和代謝通路注釋,為探究生物有機肥對鹽堿地水稻生長影響的生物學機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

本試驗地位于寧夏回族自治區銀川市賀蘭縣金貴鎮銀光村(106.43°E,38.49°N),屬于溫帶大陸性季風氣候,全年日照時數2851—3106 h,有效積溫1534.9℃,年降水量200 mm左右,時空分布不均,多集中在6—9月。試驗地土壤為淤灌土,pH 8.40、全鹽1.83 g/kg、有機質9.9 g/kg、全氮1.18 g/kg、全磷0.59 g/kg、解堿氮42 mg/kg、有效磷3.38 mg/kg、速效鉀320 mg/kg,屬于輕度鹽堿土。

1.2 試驗設計

試驗采用隨機區組排列,小區面積20 m2(5 m×4 m),小區之間起壟覆膜,單獨排灌。水稻育苗插秧種植,品種為寧粳48號。供試生物有機肥配方及(嗜)耐鹽菌種均由課題組提供,寧夏某生態肥業有限公司生產,配料中加入硅元素制成鹽堿地水稻專用生物有機肥[N+P2O5+K2O>5%,有機質>45.0%,有效活菌數(枯草芽孢桿菌、多黏類芽孢桿菌、鹽單胞菌、乳酸菌、光合細菌等)>500億/kg]；供試化肥為市售磷酸二銨(含P2O546%,N 18%)。試驗共設置4個處理,T1:生物有機肥+化肥,T2:生物有機肥滅活+化肥,T3:化肥,T4:空白對照(不施肥)。生物有機肥作為基肥,施用量為1500 kg/hm2；化肥施用量為當地農戶施肥習慣的1/2,施用量為213.75 kg/hm2,按照基肥、分蘗肥、穗肥5∶3∶2的量施用,水肥管理與大田一致。

1.3 水稻農藝性狀測定

水稻灌漿期測定健康植株葉綠素含量、葉面積指數、株高、根長、有效分蘗數,干物質量。葉綠素含量用SPAD- 502便攜式葉綠素儀測定；葉長、株高、根長用鋼卷尺測量；葉寬用游標卡尺測量；用長寬矯正法來測定葉面積(葉面積指數=葉片長×寬×0.75)[33]；干物質量采用烘干法測定,每個處理取15個重復。

1.4 樣品采集

取水稻灌漿后期葉片,用無菌水洗去灰塵后裝入2 mL凍存管中,隨即放入液氮中速凍,干冰送樣,委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成RNA的提取、質控、建庫及Illumina HiSeqTM測序,每個處理取3次重復。

1.5 文庫構建及測序

提取樣品RNA,總量≥1 μg,通過Oligo(dT)磁珠富集水稻葉片中帶有poly A尾的mRNA,隨后在NEB Fragmentation Buffer中用二價陽離子將得到的mRNA隨機打斷。以片段化的mRNA為模版,隨機寡核苷酸為引物,在M-MuLV逆轉錄酶體系中合成cDNA第一條鏈,然后用R NaseH降解RNA鏈,并在DNA polymerase I體系下,以dNTPs為原料合成cDNA第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA經過末端修復,加A尾并連接測序接頭,用AMPure XP beads篩選250—300 bp左右的cDNA,進行PCR擴增并再次使用AMPure XP beads 純化PCR產物,最終獲得文庫,然后進行轉錄組測序。

1.6 數據處理與分析

利用clusterProfiler 3.4.4軟件進行差異表達基因的GO和KEGG富集分析,P<0.05作為顯著性富集的閾值；利用SPSS軟件對葉綠素相對含量、有效分蘗數、根長、葉面積和和干物質重量進行方差分析、多重比較,株高進行非參數檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同生物有機肥處理對水稻生長的影響

由表1可知,施用生物有機肥+化肥后,水稻葉片中葉綠素含量、有效分蘗數、根長、葉面積和干物質重量均顯著高于化肥和空白對照(P<0.05),株高也大于其他處理,說明施用生物有機肥能有效促進鹽堿地水稻生長。

表1 水稻灌漿期農藝性狀

2.2 測序質量分析

為了保證數據分析的質量,在分析前對原始數據進行處理,去掉帶接頭、含無法確定堿基信息、低質量(Qphred≤20的堿基數占整個read長度的50%以上)的reads,統計見表2。整體上,每個樣品最終得到4000—7000萬條Clean reads,Q20為96.86%—98.33%,Q30為91.87%—95.09%,GC含量為50.04%—55.22%,數據整體測序錯誤率為0.03%,小于1%,表明測序質量良好,數據可用于后續生物信息學分析。

表2 轉錄組測序數據統計

2.3 不同處理差異表達基因分析

利用DESeq 2軟件比較生物有機肥不同處理下水稻葉片的基因,以P<0.05且|log2FoldChange|>0.0作為篩選基準,圖1為差異基因表達火山圖,T2和T1之間檢測到差異基因6593條,說明生物有機肥中的微生物在參與調控水稻葉片基因表達中發揮了重要作用；T4和T3之間的1866條差異基因是由施用化肥引起的,T3和T1之間的4796條差異基因是由生物有機肥引起的,說明生物有機肥對水稻葉片基因調控作用大于化肥；T4和T1之間檢測到差異基因6976條,高于T4vsT3與T3vsT1差異基因數量之和,說明生物有機肥與化肥對水稻基因調控作用具有協同作用。生物有機肥對水稻基因表達具有重要意義,因此對其進一步進行GO功能富集與KEGG富集分析。

圖1 基因火山圖

2.4 差異轉錄基因的GO富集分析

將得到的目標基因進行GO功能富集分析能夠確定差異基因的主要生物學功能,即生物學過程、細胞組分、分子功能三個主類。T2vsT1結果注釋差異基因共4780條,其中生物學過程1643條,細胞組成635條,分子功能2502條,分別占比34.37%、13.28%、52.34%,由此可以看出大多數差異基因與分子功能顯著相關,各組分最顯著的10個Term見圖2,生物學過程方面主要表現在翻譯、肽生物合成和代謝、酰胺生物合成和代謝、有機氮化合物的生物合成、DNA構象變化等方面；在細胞組分中,主要參與核糖體、細胞內核糖核蛋白復合物、核糖核蛋白復合體、非膜細胞器、細胞內非膜細胞器、細胞質部分、細胞質等方面；在分子功能中,主要集中在核糖體的結構成分和結構分子活性等方面。

圖2 T2vsT1差異基因本體功能富集分析

T3vsT1共注釋到差異基因3829條,生物學過程1335條,細胞組成506條,分子功能1988條,分別占比34.87%、13.21%、51.92%,可以看出施用生物有機肥影響水稻葉片的分子功能,各組分最顯著的10個Term見圖3,生物學過程主要表現在光合作用、翻譯、肽生物合成與代謝、酰胺生物合成與代謝；細胞組分中,主要參與類囊體、類囊體部分、光系統、膜蛋白復合物、光合膜、核糖體、光系統II、高爾基體相關囊泡、高爾基體相關囊泡膜、細胞質部分、核糖核蛋白復合體、細胞質和細胞內核糖核蛋白復合物等方面；在分子功能中,主要集中在結構分子活性、核糖體的結構成分、轉錄因子活性,序列特異性DNA結合、核酸結合轉錄因子活性等方面。

圖3 T3vsT1差異基因本體功能富集分析

T4vsT1共注釋到差異基因5252條,生物學過程1840條,細胞組成731條,分子功能2681條,分別占比35.03%、13.92%、51.05%,說明生物有機肥與化肥聯合作用能有效促進葉片基因差異表達,各組分最顯著的10個Term見圖4,生物學過程主要表現在翻譯、肽生物合成與代謝、細胞酰胺生物合成與代謝、有機氮化合物的生物合成、光合作用、蛋白質轉運等方面；細胞組分中,主要參與核糖體、核糖核蛋白復合體、細胞內核糖核蛋白復合物、細胞質部分、細胞質、非膜細胞器、細胞內非膜細胞器等方面；在分子功能中,主要集中在結構分子活性、核糖體的結構成分、RNA結合、翻譯因子活性,RNA結合、rRNA結合等方面。

圖4 T4vsT1差異基因本體功能富集分析

T4vsT3共注釋到差異基因1396條,生物過程523條,細胞組成131條,分子功能742條,分別占比37.46%、9.38%、53.15%,差異顯著的基因集中在細胞組分和分子功能,可以看出施用化肥主要對水稻葉片的生物學過程影響較小,各組分最顯著的10個Term見圖5。在細胞組分中,差異基因主要參與的生物學過程包括類囊體、類囊體部分、光合膜等方面；在分子功能中,差異基因主要集中在血紅素結合、四吡咯結合、氧化還原酶活性作用于成對的供體上并結合或還原分子氧、鐵離子結合等方面。

圖5 T4vsT3差異基因本體功能富集分析

2.5 差異基因KEGG通路富集分析

為了進一步表達差異基因的生物學行為,根據KEGG數據庫注釋結果,對生物有機肥不同處理下,鹽堿地水稻葉片差異基因進行分析。

T2vsT1共有965條差異基因注釋到KEGG數據庫中,分布在112個分類代謝途徑中,最顯著的20個通路見圖6,涉及差異基因最多的代謝通路是核糖體(142條),其次是植物激素信號轉導(55條)、剪接體(47條)、植物-病原體相互作用(45條)、氨基酸生物合成(41條)、碳代謝(40條)、嘌呤代謝(38條)、MAPK信號傳導途徑-植物(35條)、內質網中蛋白質加工(34條)、胞吞作用(30條)等,其中有2個代謝通路顯著富集(P<0.05),分別是核糖體和光合作用(22條)。

圖6 T2vsT1差異基因KEGG富集通路

T3vsT1共有732條差異基因得到注釋,分布在109個分類代謝途徑中,最顯著的20個通路見圖7,涉及差異基因最多的代謝通路是核糖體(81條),其次是碳代謝(43條)、植物激素信號轉導(40條)、內質網中蛋白質加工(32條)、氨基酸生物合成(31條)、谷胱甘肽代謝(30條)、氨基糖和核苷酸糖代謝(26條)、苯丙烷生物合成(26條)、MAPK信號傳導途徑-植物(25條)、半胱氨酸和蛋氨酸代謝(24條)等,其中有4個代謝通路顯著富集(P<0.05),分別是核糖體、光合作用、光合作用-天線蛋白和谷胱甘肽代謝。

圖7 T3vsT1差異基因KEGG富集通路

T4vsT1共有1076條差異基因得到注釋,分布在109個分類代謝途徑中,最顯著的20個通路見圖8,涉及差異基因最多的代謝通路是核糖體(147條)、碳代謝(71條)、氨基酸生物合成(48條)、RNA轉運(46條)、內質網中蛋白質加工(45條)、嘌呤代謝(35條)、剪接體(35條)、植物激素信號轉導(34條)、光合作用(32條)、谷胱甘肽代謝(32條)等,有5個代謝通路顯著富集(P<0.05),分別是核糖體、光合作用、光合作用-天線蛋白、鞘脂代謝、卟啉與葉綠素代謝。

圖8 T4vsT1差異基因KEGG富集通路

T4vsT3共有263條差異基因得到注釋,共100條代謝通路,最顯著的20個通路見圖9,涉及差異基因最多的代謝通路是苯丙烷生物合成(21條)、碳代謝(21條)、植物激素信號轉導(17條)、氨基酸生物合成(17條)、乙醛酸和二羧酸代謝(13條)、脂肪酸降解(12條)、光合作用(12條)、糖酵解/糖異生(12條)、脂肪酸代謝(11條)、MAPK信號傳導途徑-植物(11條)等,有7個代謝通路顯著富集(P<0.05),是脂肪酸降解、光合作用、苯丙烷生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝、不飽和脂肪酸生物合成、α-亞麻酸代謝、脂肪酸代謝。

圖9 T4vsT3差異基因KEGG富集通路

各組差異基因KEGG顯著富集通路統計見表3,結果表明,施用生物有機肥后,核糖體和光合作用代謝通路顯著富集(P<0.05),與前文GO分析中核糖體和光合作用相互佐證,說明鹽堿地施用生物有機肥誘導水稻葉片中的RNA合成蛋白質,對其光合作用具有顯著影響；谷胱甘肽是生物體內最主要的非蛋白巰基和含量最豐富的低分子量多肽,具有很強的抗氧化性,參與植物抗逆中的多項功能活動[34],在本研究中,T3vsT1和T4vsT1中谷胱甘肽代謝通路基因上調23和27條,下調7和5條,說明生物有機肥能夠提高鹽堿地水稻抗逆性。

表3 差異基因 KEGG顯著富集通路

2.6 差異基因耐鹽轉錄因子分析

轉錄因子是細胞響應外界脅迫以后主要調控某些基因轉錄的調控因子[35]。目前,已鑒定出參與植物鹽脅迫應答反應的轉錄因子有AP2/EREBP、MYB、WRKY以及bZIP轉錄因子家族成員[36]。圖10為各組差異基因注釋在轉錄因子家族的基因數量,T2vsT1中4個轉錄因子家族共有111條差異基因,其中上調39條(MYB家族23條),下調72條(AP2家族23條,MYB家族22條,WRKY家族21條)；T3vsT1共有93條差異基因,上調44條(AP2家族10條,bZIP家族10條,MYB家族15條),下調49條(AP2家族20條,MYB家族15條,WRKY家族10條)；T4vsT1共有97條差異基因,上調53條(AP2家族19條,bZIP家族11條,MYB家族18條),下調44條(AP2家族13條,MYB家族19條),T4vsT3共有40條差異基因,上調24條(AP2家族11條),下調18條(MYB家族13條)。

圖10 響應鹽脅迫家族基因數量統計

3 討論

轉錄組學是功能基因組學的重要組成部分,它是從整體水平上研究細胞中基因轉錄的情況及其轉錄調控規律[37]。植物對逆境脅迫的響應機制十分復雜,當細胞感受到逆境脅迫時,相應的受體將會收到信號,控制相關的基因表達,并產生生理反應,同時在轉錄和翻譯等水平做出應答[38]。本研究中,從水稻農藝性狀可以看出,施用生物有機肥能有效減輕鹽分對水稻的脅迫,促進鹽堿地水稻生長。對不同生物有機肥處理下鹽堿地水稻葉片進行轉錄測序分析,Q30堿基百分比大于91.87及以上,表明測序質量良好,滿足轉錄組分析的基本要求。

施肥不僅可以開啟一些基因上調表達,同時也可以關閉一些基因表達(基因沉默),還可以調節一些基因下調表達[39]。王鎣燕[40]在NPK定位實驗中發現,化肥配施農家肥能明顯促進16S rRNA和nosZ基因拷貝數。本研究GO功能分析中,T2vsT1中差異基因引起顯著差異的功能有16個,T3vsT1中有36個,T4vsT1中有60個,說明施用生物有機肥能有效刺激水稻葉片基因差異表達,這些差異基因在生物學過程中細胞學過程、代謝過程相關基因分布較多；細胞組分中主要集中在細胞器、細胞器膜；在分子功能中差異顯著表達基因與結合、催化活性有關。張敏瑜[41]接種AM真菌和Foc4能誘導巴西蕉的基因差異表達,且2株菌同時接種時差異基因顯著表達量大于單株菌的表達量。Chandra研究結果表明[42],耐鹽解淀粉芽孢桿菌能夠調節水稻基因差異表達提高水稻耐鹽性。本研究中,T2vsT1中差異顯著上調基因均大于下調數量,說明生物有機肥中的枯草芽孢桿菌等(嗜)耐鹽菌株對鹽堿地水稻生物學過程具有重要的影響。

核糖體是最古老的、精細復雜的細胞器,其結構和組成從原核到真核保持著高度的保守性[43],是細胞機制的一個重要部分,負責蛋白質合成,在控制細胞生長、分裂和發育中起著重要作用[44],核糖體相關基因表達可能會影響生物體的一些機能。謝麗霞[45]從極端嗜鹽曲霉核糖體中克隆出SpRPS3ae和SpRPL44兩條蛋白基因導入植物和微生物中均能有效提高其抗鹽性,夏麗丹等[46]在分析鹽膚木對鉛脅迫的響應時發現,核糖體相關基因是鹽膚木應對鉛脅迫的主要調節基因。在本研究中,差異表達基因的GO與KEGG的分析中均發現,核糖體相關基因在T2vsT1、T3vsT1、T4vsT1中均差異表達,說明核糖體內可能是鹽堿地水稻施用生物有機肥后應對鹽堿環境的重要調節基因。

光合作用是植物產生能量的主要途徑,葉片是植物進行光合作用的重要器官,對植物的生長發育至關重要[25]。但鹽堿脅迫會造成植物細胞膜損傷、氣孔關閉、CO2同化速率降低,從而降低光合速率、蒸騰速率、氣孔開放、細胞間CO2濃度和葉綠素含量影響水稻生長發育,從而影響作物產量[47—48]。本研究中KEGG代謝途徑的生物信息學分析發現,T3vsT1和T4vsT1中光合作用和光合作用-天線蛋白代謝通路基因均顯著上調,而光合作用-天線蛋白是光反應中原初反應中的一類補光蛋白復合體,能夠捕獲光能并把能量傳遞至反應中心[25],說明施用生物有機肥能有效促進鹽堿地水稻葉片對光能的捕獲,從而增強水稻光合作用。

植物激素不但調控植物的生長發育,而且還參與植物的非生物脅迫[25],在T2vsT1、T3vsT1和T4vsT1中分別有55條、40條、34條差異基因注釋在植物激素信號傳導通路上,涉及的植物激素有生長素、細胞分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯、油菜素甾醇、茉莉素和水楊酸,意味著施用生物有機肥對植物激素具有一定影響,脫落酸是植物利用類胡蘿卜素參與合成的一種應激反應激素[49],能激發質膜結合通道或從細胞內Ca2+儲存庫釋放Ca2+與第二信使Ca2+整合,幫助植物在鹽脅迫下存活[50],在植物應對環境脅迫中發揮著重要作用[51]。在本研究中類胡蘿卜素生物合成通路基因在T3vsT1中上調5條、下調1條,在T4vsT1中上調10條,無下調基因,說明鹽堿地施用生物有機肥能促進類胡蘿卜素生物合成,促進水稻抗性提高。

植物經常受到病原性細菌、真菌、病毒、線蟲等的攻擊[52],但是植物具有天生的免疫系統來抵御病原體[53],當受到病原體攻擊時,每個細胞都能夠自主識別和應對病原體[54]。枯草芽孢桿菌能有效防治水稻的紋枯病[55]、稻瘟病[56]等病害,本研究中T3vsT1和T4vsT1中植物-病原體相互作用代謝通路上調基因數量大于下調基因數量,說明施用生物有機肥在一定程度上能夠激活鹽堿地水稻葉片自身對病原體的抗性,微生物在其中可能發揮了重要作用,在T2中對生物有機肥進行了滅活處理,但在T2vsT1中上調基因數量小于下調基因,其原因需要進一步研究。

參與響應鹽脅迫的轉錄因子在鹽脅迫下呈現出不同的應答反應模式,表明這些轉錄因子在鹽脅迫應答途徑中扮演著不同的角色[36]。AP2/EREBP是一個大的轉錄因子家族,包含EREBP和AP2等2個亞族。研究證實,AP2/EREBP轉錄家族基因與植物逆境響應有關[57],MYB蛋白在包括鹽脅迫在內的植物非生物脅迫調控中有重要作用[58],WRKY轉錄因子具有高度保守的WRKY結構域,能夠參與損傷、衰老、發育、抗病等抗逆反應[59]。不同生物有機肥處理誘導鹽脅迫下水稻葉片響應鹽脅迫的轉錄因子家族基因開始表達,其中施生物有機肥能促使水稻葉片已知響應鹽脅迫的家族基因差異表達,主要參與鹽脅迫響應的基因都屬于AP2和MYB轉錄因子家族,說明施用生物有機肥能有效促進植物響應鹽脅迫基因表達,增強作物耐受性。

4 結論

以生物有機肥不同處理下的鹽堿地水稻葉片為研究材料,運用RNA-Seq技術進行轉錄組測序,并對差異基因進行GO和KEGG代謝通路富集分析,解析其參與的生物學功能和代謝途徑。施用生物有機肥能夠改變鹽堿地水稻基因表達,從而調控水稻的生物學功能和代謝過程,影響水稻的生長發育。本研究初步揭示了生物有機肥施用對鹽堿地水稻促生和抗逆作用的生物學機制。