采用星點設計-響應面法優化姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠的處方和制備工藝

李佳佳, 寧偎鋒, 李 磊

(沈陽化工大學 制藥與生物工程學院, 遼寧 沈陽 110142)

姜黃素[1-2][1,7-雙-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5二酮]是從姜黃中提取的多酚化合物,具有抗氧化功能,被研究發現具有保護肝臟作用[3-4]、抗癌作用[5-6]、以及對神經退行性疾病和炎癥性疾病的治療作用[7].相關文獻曾報道用質量分數為0.01%～0.25%姜黃素補充嚙齒動物飲食,其通過抑制NF-κB、STAT3和MCP-1的過表達來保護微血管免受缺血再灌注損傷,進而達到治療青光眼的目的[8].但姜黃素的水溶性差、生物利用度低,限制了其在臨床中的應用.對于眼科疾病的治療,大多數藥物由于淚液稀釋或者滴眼劑的流出并不能達到很好的療效.局部給藥是優選的給藥途徑,能減少全身吸收的副作用,可加快藥物代謝和清除[9-11].本研究制得的空白凝膠基質,在常溫下為液態,給藥后立即在用藥部位轉化為半固態的凝膠,并結合姜黃素納米混懸液制得一種姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠,為姜黃素在眼科方面的應用提供了一種思路.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

姜黃素 (天津市天新精細化工開發中心)、泊洛沙姆188 (P188,上海思域化工科技有限公司)、泊洛沙姆407 (P407,浙江瑪雅試劑有限公司)、羧甲基殼聚糖(CMC,山東西亞化學科技有限公司)、戊二醛(GA,天津博迪化工股份有限公司)、去離子水(浙江杭州娃哈哈集團有限公司),均為分析純.

AR1530精密電子天平,美國奧豪斯公司;DZF-6020型真空干燥箱,上海精宏實驗設備有限公司;RC-6型溶出度測試儀,天津市國銘醫藥設備有限公司;冰箱,山東澳柯瑪股份有限公司;數控超聲波清洗儀,上海必能信超聲波有限公司;透析袋,南京森貝伽生物科技有限公司;恒溫加熱磁力攪拌器,鞏義予華儀器有限責任公司.

1.2 姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠的制備

采用反溶劑法制備姜黃素納米混懸液[12-14].取處方量的姜黃素溶于乙醇配置姜黃素乙醇溶液.按ω(乙烯醇)∶ω(姜黃素)=1.5∶1配置聚乙烯醇溶液.在350 r/min轉速下,將姜黃素乙醇溶液注入聚乙烯醇溶液中,持續攪拌5 min,制得姜黃素納米混懸液,暫存于4 ℃冰箱中.

采用攪拌子法制備空白凝膠基質.將一定量P407、P188和CMC溶于去離子水,放入55 ℃恒溫加熱磁力攪拌器中,向其中滴加一滴戊二醛,繼續攪拌半小時.反應停止后在室溫下冷卻24 h,使用預先浸泡的纖維素膜(8000～14 000Mw.t)透析24 h,得到空白凝膠基質(如圖1所示).

將姜黃素納米混懸液從冰箱中取出,在高速磁力攪拌下緩慢加入空白凝膠基質,持續攪拌使其分散均勻,放入4 ℃冰箱冷卻24 h以上,直至溶液澄清透明,得姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠.

圖1 空白凝膠基質的制備流程

1.3 星點設計-響應面法優化設計

從4 ℃冰箱中取出空白凝膠基質,用模擬淚液稀釋,輕搖振蕩,放置至無氣泡.測出淚液稀釋前后的膠凝溫度,t1為模擬淚液稀釋前的相變溫度,t2為模擬淚液稀釋后的相變溫度.

根據星點設計-響應面法,采用Design-expert 8軟件,將單因素實驗確定的P407與P188質量分數比、CMC體積分數、GA體積分數設置為自變量,t1、t2為響應指標,對檢測結果進行多項回歸、擬合方程、方差分析和失擬檢驗,生成二維高線圖和三維響應面圖.根據t1≥ 25 ℃和t2≤ 33 ℃,優化出兩種最適制備處方,并對其預測值與實測值進行偏差分析.

1.4 結構表征

采用日本電子株式會社GSM-6701F型掃描電鏡(SEM)對姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠進行形態測試,取真空干燥粉碎后的姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠,在其表面噴金,在20 kV加速電壓下觀察其表面形態;采用日本理學RigkuD/max-1200型X射線衍射儀(XRD)對姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠進行測試,掃描速度為1.2 (°)/min,掃描范圍為5°～50°;采用天津港東FTIR-650型傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)對樣品進行測試,掃描范圍為400 ～4000 cm-1;采用上海菁華科技儀器有限公司752型紫外可見分光光度計(UV-Vis)測定樣品的吸光度.

1.5 性能測試

1.5.1 包封率和載藥量測定

1.5.2 溶脹率測定

1.5.3 姜黃素體外釋放率測定

稱取適量的姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠、姜黃素納米混懸液(含姜黃素5 mg)和5 mg姜黃素,分別放入透析袋中,將其置于100 mL模擬淚液中,然后全部放置于33 ℃恒溫水浴槽中.從釋放開始至第30、60、100、150、200、250、300及350 min時各取5 mL淚液,離心取1 mL上清液,用乙醇稀釋至10 mL,測定其在427 nm處的吸光度.再補充5 mL相同模擬淚液至體系中,保持總體積不變.根據標準曲線計算不同釋放時間藥物溶出百分率,并對時間作圖,繪制溶出曲線.載藥水凝膠釋藥率計算公式為:釋藥率 =(釋藥質量/載藥質量)×100%.

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果分析

2.1.1 泊洛沙姆比例對膠凝溫度的影響

經過預實驗,篩選出以P407與P188質量分數比為3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1制得空白凝膠基質.其他實驗參數為:戊二醛體積分數為2%、反應溫度為55 ℃、攪拌速度為10 r/s、CMC體積分數為15%.圖2(a)是P407與P188質量分數比對臨界相變溫度的影響曲線.由圖2(a)可知P407與P188質量分數比對臨界相變溫度影響較大.因此,初步選定P407與P188質量分數比為3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1來進行響應面優化.

2.1.2 姜黃素質量濃度對膠凝溫度的影響

以P407與P188質量分數比為6∶1(即P407質量分數為18%,P188質量分數為3%)、CMC體積分數為15%、GA體積分數為2%、反應溫度為55 ℃、攪拌速度為10 r/s制得空白凝膠基質.將空白凝膠基質與質量濃度為5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L的姜黃素乙醇溶液混合制得姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠.圖2(b)是姜黃素質量濃度對臨界相變溫度的影響曲線.由圖2(b)可知姜黃素的質量濃度對膠凝狀態未見顯著影響.

2.1.3 戊二醛體積分數對膠凝溫度的影響

選定P407與P188質量分數比為6∶1、攪拌速度為10 r/s、反應溫度為55 ℃,分別加入體積分數為1%、2%、3%、4%、5%的戊二醛制備空白凝膠基質.圖2(c)為戊二醛體積分數對臨界相變溫度的影響曲線.由圖2(c)可知:隨著戊二醛體積分數的增大,臨界相變溫度逐漸降低;當戊二醛體積分數為3%時,膠凝時間最適宜;當戊二醛體積分數過大,反應液會直接凝固并喪失溫敏特性.

2.1.4 CMC體積分數對膠凝溫度的影響

選定質量分數比為6∶1的P407和P188,向其中加入體積分數為10%、12%、14%、16%、18%、20%的CMC,在55 ℃時,轉速為10 r/s,加入體積分數為3%的戊二醛制備空白凝膠基質.使用分度值為0.1的溫度計測其臨界相變溫度.圖2(d)是CMC體積分數對臨界相變溫度的影響曲線.由圖2(d)可知膠凝的相變溫度隨CMC的體積分數增加而降低.

2.1.5 反應溫度對膠凝溫度的影響

選定質量分數比為6∶1的P407和P188,轉速為10 r/s,分別在反應溫度為40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65℃時,向反應液中滴加體積分數為2%的戊二醛,測定制得的空白凝膠基質的臨界相變溫度.圖2(e)是反應溫度對臨界相變溫度的影響曲線.由圖2(e)可知反應溫度對臨界相變溫度并未產生顯著影響.

圖2 單因素對膠凝狀態的影響

綜合單因素實驗結果發現姜黃素質量濃度和反應溫度對臨界相變溫度的影響較小,即對膠凝狀態影響較小;而P407與P188的質量分數比、CMC的體積分數和GA的體積分數對膠凝狀態影響較顯著,需要進一步進行處方工藝優化.

2.2 星點設計-響應面法優化分析

根據表1中的星點設計因素和水平進行姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠的制備工藝優化. Design-expert 8軟件生成的多元線性回歸及二項式擬合方程為:

t1=27.61-27A-1.55B-0.098C+1.19AB+0.13AC+0.32BC+0.86A1+1.05B1+0.56C1(R2=0.8732),

t2=31.17-2.65A-1.30B+0.076C-0.056AB-0.28AC+0.52BC+1.22A1+0.93B1+0.97C1(R2=0.9356).

其中:A為P407與P188的質量分數比;B為CMC的體積分數;C為GA的體積分數.可見擬合度較好.響應面模擬結果方差分析t1和t2的P<0.000 1.失擬項檢驗結果表明t2的結果也好于t1.

表2為星點設計及效應值,圖3和圖4分別為P407與P188質量分數比、CMC體積分數、GA體積分數對t1和t2三維響應面圖.由表2、圖3和圖4可知:P407與P188的質量分數百分比和CMC的體積分數對臨界相變溫度影響較大;當P407與P188質量分數比和CMC體積分數取值較小時,圖形平面性較明顯,反應了取值較為恰當.

表1 星點設計因素和水平

表2 星點設計及效應值

圖3 P407與P188質量分數比、CMC體積分數和GA體積分數對t1三維響應面圖

由Design-expert 8軟件進行優化,再結合二維等高線和三維響應面,選取了兩個優化處方來制備此劑型,如表3所示.優化處方1∶P407與P188的質量分數比為7∶1,CMC體積分數為13.90%,GA體積分數為2%.優化處方2:P407與P188的質量分數比為5∶1,CMC體積分數為14.5%,GA體積分數3%.由表3中優化處方1和優化處方2的預測值與實測值偏差分析結果可知兩處方偏差值均在±1%以內,符合眼部用藥要求,即t1≥ 25 ℃、t2≤ 33 ℃.

圖4 P407與P188質量分數比、CMC體積分數和GA體積分數對t2三維響應面圖

表3 姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠優選處方

2.3 凝膠載藥性能分析

對凝膠載藥性能的研究是判斷此劑型功能的重要標準之一.表4是兩個優化處方制得的凝膠包封率和載藥量比較,圖5是兩個優化處方制得的凝膠溶脹率比較.由表4可知:與優化處方1相比,處方2的包封率和載藥量性能較好.由圖5可知:隨著P407與P188質量分數比增大,以及戊二醛體積分數減少,包封率和載藥量越高,溶脹率越大.這可能與凝膠的三維孔洞有關,孔徑越疏松,孔隙越多,藥物更容易擴散,短時間內即可達到載藥平衡.

表4 兩個優化處方制得的凝膠包封率和載藥量比較

圖5 兩個優化處方制得的凝膠溶脹率曲線

2.4 SEM分析

圖6為姜黃素納米混懸液和姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠的SEM照片(×60 000).

圖6 樣品SEM圖

由圖6可知:姜黃素納米混懸液中粒子均呈球狀,分布較均勻,且制備成姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠對納米粒子形態無影響.

2.5 FT-IR分析

圖7是羧甲基殼聚糖、泊洛沙姆和空白凝膠基質的紅外測試曲線.由圖7可知:羧甲基殼聚糖在 3200～3600 cm-1顯示出非常強大的峰,這可能是—OH的拉伸振動和—NH的振動導致的.但是,在空白凝膠基質紅外曲線中,此峰發生了變化,這可能與—NH2消失有關.1617 cm-1處左右的峰可能是由于—NH2的變形振動以及與—COO—基團的不對稱拉伸振動重疊而產生的強峰,但產物中并未出現此峰.泊洛沙姆紅外曲線中可能由于—CH拉伸、—CH2彎曲、面內—OH彎曲和—CO拉伸,分別在2889.73、1467.29、1343.46 cm-1處出現了特征峰,這些峰在空白凝膠基質中表現不明顯或者消失不見.以上結果表明空白凝膠基質已成功合成.

圖7 羧甲基殼聚糖、泊洛沙姆和空白凝膠基質的紅外曲線

2.6 XRD分析

圖8為羧甲基殼聚糖、泊洛沙姆、泊洛沙姆與CMC物理混合物和空白凝膠基質的XRD曲線.由圖8可知:泊洛沙姆特征峰在20.03°和24.43°,羧甲基殼聚糖特征峰在21.30°.在泊洛沙姆與CMC物理混合物中,盡管峰很低,但也表現出兩者峰的特征.所制得的空白凝膠基質XRD曲線中沒有峰存在.

圖8 XRD曲線

2.7 體外釋放率

圖9是姜黃素、姜黃素納米混懸液和姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠隨時間變化的體外釋放率曲線.

圖9 姜黃素、姜黃素納米混懸液和姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠的體外釋放率曲線

由圖9可知:姜黃素在淚液中的釋放非常緩慢,在200 min時,依據處方2制備的姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠的累積釋放率為13.2%,姜黃素納米混懸液的累積釋放率為17%.與姜黃素納米混懸劑相比,姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠可以達到緩釋效果,且藥物釋放有明顯的時滯現象.在釋放初期,處方2的藥物的釋放率出現突釋現象,這可能是大量的姜黃素吸附在水凝膠表面而不是包埋在凝膠的孔狀結構中,藥物未達到孔徑的飽和程度所導致的.

3 結 論

本文制備了一種溫敏性的姜黃素納米水凝膠劑,并進行了體外性能測試,期望進一步拓展姜黃素在臨床中的用途.首先,采用反溶劑法制得姜黃素納米混懸劑,并將其載入以P407、P188與CMC交聯所得的空白凝膠基質中,制備出姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠,并進行掃描電鏡、紅外光譜以及X射線衍射表征;然后,采用單因素法發現P407與P188的質量分數比值、GA體積分數以及CMC體積分數對此劑型的制備有顯著影響;最后,對這3種影響因素進行星點設計-響應面法優化并進行體外釋放性能的比較.結果顯示:P407與P188的質量分數比為5∶1、CMC體積分數為14.5%、GA體積分數為3%時,姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠具有緩釋作用.本研究為該制劑的后續體內外研究奠定一定的基礎,為姜黃素在眼科的臨床應用提供了新思路.