基于GC-MS結合保留指數法建立花椒揮發油指紋圖譜

葉洵，劉子博，張婷，張萌萌，何林，王丹，彭偉，吳純潔

(成都中醫藥大學 藥學院，成都 611137)

花椒為蕓香科植物花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)的干燥成熟果皮[1]。花椒是家庭常用調味品，深受人們的喜愛，最早在春秋戰國時期記載使用。花椒含有豐富的揮發油、酰胺等活性物質，在醫療領域也有一定的應用價值，具有溫中行氣、驅寒、止痛、殺蟲等功效，可用于緩解胃痛、嘔吐以及腹瀉等癥狀。到目前為止，從科學研究到生產，研究人員和操作人員對花椒的分類依據都不同，叫法各異，這導致了國內花椒的品種和名稱的混亂，給生產和銷售帶來諸多不便，產品質量不一[2-3]。花椒商品依據顏色分類，分為“紅花椒”和“青花椒”。其中，“紅花椒”的知名產區為四川漢源和茂汶、陜西韓城、甘肅武都等地區，而“青花椒”的知名產區則是四川金陽和洪雅、重慶江津等地區。根據栽培品種分類，主要有漢源貢椒、正路花椒、大紅袍、大紅椒、小紅椒、金陽青花椒、洪雅藤椒等品種[4]。花椒與中藥材性質類似，其質量受種植地的經緯度、氣候(日照時間、降雨量、干燥度等)以及土壤等因素的影響較大，各地種植的花椒品質差異較大，導致花椒揮發油成分含量也有所不同[5-6]，揮發性香味成分是構成和影響其加工產品質量的重要因素。

指紋圖譜技術多用于鑒別道地藥材，因此可采用該技術建立花椒揮發油指紋圖譜，作為花椒產地鑒別的依據[7]。本研究采用水蒸氣蒸餾的方法提取花椒揮發油，建立花椒揮發油GC-MS指紋圖譜，分析揮發油化學成分差異，結合保留指數法、聚類分析和主成分分析對不同產地的花椒揮發油成分進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10批花椒樣品具體信息見表1，于2019年8月-10月采集，經成都中醫藥大學藥學院李敏教授鑒定為蕓香科植物花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)的干燥成熟果皮。

表1 10批花椒藥材名稱及來源Table 1 The names and sources of 10 batches of Z. bungeanum

正己烷、無水硫酸鈉(分析純)：購自成都市科隆化學品有限公司；正構烷烴(C10～C25)：購自成都埃法生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

揮發油提取器 四川蜀牛玻璃儀器有限公司；QE-100二兩裝高速粉碎機 浙江省蘭溪市偉能達電器有限公司；Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀、Agilent GC-MSD工作站 美國安捷倫公司；Sartorius BP211D電子天平 德國賽多利斯公司；MH-1000調溫型電熱套 北京科偉永興儀器有限公司。

2 實驗方法與結果

2.1 指紋圖譜研究

2.1.1 色譜-質譜條件

氣相色譜柱為HP-5MS毛細管質譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；載氣為氦氣(He)，流速為1 mL/min；程序升溫：初始溫度為50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至150 ℃，最后以25 ℃/min升至240 ℃；進樣量為1 μL，采用分流模式，分流比為30∶1；溶劑延遲5 min；離子源溫度為230 ℃；EI電離，電子能量為70 eV；掃描模式為全掃描模式；質譜數據標準譜庫為NIST 14.L。在相同實驗條件下檢測所有供試品，記錄樣品GC-MS總離子流圖。

2.1.2 花椒揮發油提取

按照2020年版《中國藥典》四部(通則2204)中揮發油測定法，采用揮發油蒸餾法提取花椒揮發油。具體操作：花椒樣品粉碎通過2號、3號篩混合均勻。取粉末適量20 g，稱定重量(準確至0.01 g)，置于500 mL圓底燒瓶中，加10倍量水與玻璃珠數粒，連接揮發油測定器與回流冷凝管，放入電熱套中緩緩加熱至沸騰，并保持微沸約5 h，至測定器中油量不再增加，停止加熱，冷卻后，讀取揮發油體積，并計算供試品中揮發油的含量。加適量無水硫酸鈉放于-20 ℃保存過夜。

2.1.3 樣品溶液制備

花椒樣品溶液：精密吸取揮發油溶液50 μL，加正己烷定容至5 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

正構烷烴溶液：精密吸取C10～C25正構烷烴100 μL，加正己烷定容至1 mL，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得0.1 mg/mL正構烷烴溶液。

2.1.4 保留指數(RI)的計算

按照2.1.1項實驗條件，吸取花椒樣品溶液與正構烷烴溶液進行檢測，獲得總離子色譜圖。根據二者的保留時間，計算待鑒定化合物的保留指數RI，將獲得的RI值與文獻RI值進行比較。

保留指數的計算公式為：

(1)

式中：tR為保留時間，min；x為供試品化合物；Z、Z+1為待分析物前后兩個正構烷烴的碳原子數，即tR(Z)

2.1.5 精密度考察

取1份供試品溶液，按照2.1.1的色譜條件，連續進樣6次，進樣量1 μL，記錄總離子流圖。以芳樟醇為參照峰，計算共有峰保留時間RSD值均小于3%，峰面積RSD值均小于3%，表明儀器具有良好的精密度。

2.1.6 穩定性考察

取2.1.3項的供試品溶液，按照2.1.1的色譜條件，于0，2，4，8，12，24 h測定峰面積，以芳樟醇為參照峰，計算共有峰保留時間RSD值均小于3%，峰面積RSD值均小于3%，表明花椒揮發油在24 h內穩定。

2.1.7 重復性考察

取6份同一批次花椒藥材粉末，按照2.1.2和2.1.3中供試品溶液的制備方法制備，按照2.1.1的色譜條件，進樣1 μL，記錄總離子流色譜圖。以芳樟醇為參照峰，計算其他峰保留時間RSD值均小于3%，峰面積RSD值小于3%，表明該方法重復性較好，適合花椒指紋圖譜的研究。

2.1.8 指紋圖譜的建立

2.1.8.1 花椒揮發油成分共有峰確認

GC-MS總離子流圖顯示：花椒揮發油確定了28～37個峰，共有峰23個，共有峰面積占總峰面積86%以上，以D-Limonene、Linalool、Geranyl acetate、Caryophyllene、γ-Elemene、Humulene、Germacrene D、β-Myrcene、α-Terpineol等為主，具體結果見表2。

表2 10批花椒揮發油GC-MS分析結果Table 2 The analysis results of 10 batches of Z. bungeanum volatile oils by GC-MS

2.1.8.2 指紋圖譜的建立

將其導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012版)，以表1中M2為參照圖譜，時間寬度設為0.10 min，多點校正后，生成花椒揮發油共有模式對照指紋圖譜，標定23個峰，10批花椒揮發油樣品指紋圖譜疊加圖見圖1，對照圖譜見圖2。

圖1 10批花椒揮發油樣品指紋圖譜疊加對照圖Fig.1 The fingerprint spectra overlay reference diagram of 10 batches of Z. bungeanum volatile oil samples

圖2 花椒揮發油對照指紋圖譜Fig.2 The reference fingerprint spectra of Z. bungeanum volatile oils

各批次花椒揮發油色譜圖與對照圖譜相似度結果見表3。

表3 10批花椒揮發油對照圖譜相似度Table 3 The similarity of reference fingerprint spectra of 10 batches of Z. bungeanum volatile oils

由表3可知，10批花椒揮發油樣品的相似度較好，均大于0.9，表明各產地的花椒質量具有較高的一致性。

2.2 不同產地花椒揮發油成分差異研究

揮發油是花椒香氣的主要成分，花椒揮發油含量的多少可直接反映花椒香味程度。花椒揮發油含量是反映花椒風味物質的一項重要指標。根據式(2)計算樣品中揮發油含量。

(2)

花椒揮發油含量測定結果見表4。

表4 10批花椒揮發油含量的分析結果Table 4 The analysis results of 10 batches of Z. bungeanum volatile oil content

由表4可知，不同產地花椒揮發油含量在2.8%～6.7%之間。不同產地的花椒揮發油含量有差異，且同一產地的花椒揮發油含量也有所不同。其中10批花椒樣品中，揮發油含量最多的是茂縣花椒，為6.7%，含量最少的是甘肅武都，為2.8%，但均滿足2020年版《中國藥典》規定的揮發油含量不低于1.5%。

2.3 不同產地花椒揮發油聚類分析

系統聚類分析可根據樣品之間的親疏遠近關系進行分類，樣品的相似度越大，兩者之間的距離越近。適合樣品數量較少時的聚類分析，最終輸出樹狀圖的聚類結果。根據本實驗所得花椒總離子流色譜圖，經過化學成分差異分析，分析不同產地花椒樣品揮發油的共有峰，并將共有峰峰面積作為花椒揮發油聚類分析的分析對象，將數據導入SPSS 25.0軟件，采用瓦爾德法，并用歐氏距離的平方為測度對其進行聚類分析。

系統聚類分析結果見圖3。

圖3 10批花椒揮發油聚類分析結果Fig.3 The cluster analysis results of 10 batches of Z. bungeanum volatile oils

由圖3可知，當類間距離為20時，10批樣品分為兩大類；H1、H2、H3為一類，其他聚為一類。當類間距離為10時，10批樣品被分為三大類：M4聚為一類，H1、H2、H3聚為一類，其余為一類。同一產地的花椒樣品揮發油相似度較好，但是亦被聚類分析劃分為不同的類別，說明同一產地花椒既具有一致性又存在一定的差異。

2.4 不同產地花椒揮發油主成分分析

主成分分析是一種降維的數據分析方法，根據樣品之間的相似度將樣品分為若干組。為了找出不同產地花椒揮發油質量差異性，利用SIMCA-P 14.1軟件對10批花椒揮發油共有峰峰面積進行主成分分析，以23個共有峰峰面積為變量進行PCA運算，共生成4個主成分，累積貢獻率達到97.36%，其中前2個主成分累積貢獻率達到83.23%，證明模型有效。以PCA得分和峰面積變量得到Score圖(見圖4)和Loading圖(見圖5)。漢源貢椒與茂縣大紅袍、武都大紅袍沿著t[1]軸能明顯分開，分為兩大類，各組內差異較小，無異常離群樣本，說明不同產地花椒揮發油化學成分具有較大差異。根據PCA分析結果，將漢源、茂縣和武都3個產地的樣品大致分為2組，以23個共有指紋峰峰面積積分值為變量進行PLS-DA分析，得到23個變量的VIP圖(見圖6)(R2Y=0.927，Q2=0.703，模型有效)，VIP可用來描述PLS-DA分析中變量的變異程度，通常選VIP>1的變量為特征變量。以VIP>1.0為顯著影響，共找到10個差異標志物，對其影響顯著性排序，分別為峰22>峰23>峰19>峰18>峰10>峰16>峰11>峰6>峰14>峰20>峰1，說明不同產區的花椒揮發油中Germacrene D、(+)-delta-Cadinene、Caryophyllene、Geranyl acetate、Linalool、α-Terpinyl acetate、(E,Z)-2,6-Dimethylocta-2,4,6-triene、trans-β-Ocimene、Nerol和γ-Elemene的含量存在顯著差異，可作為不同產地花椒揮發油質量差異的主要共有峰。

圖4 10批花椒揮發油Score圖Fig.4 The score diagram of 10 batches of Z. bungeanum volatile oils

圖5 10批花椒揮發油Loading圖Fig.5 The loading diagram of 10 batches of Z. bungeanum volatile oils

圖6 10批花椒揮發油VIP圖Fig.6 The VIP diagram of 10 batches of Z. bungeanum volatile oils

3 討論

揮發油作為花椒風味物質的主要成分之一，本研究采用GC-MS技術，測定花椒揮發油總離子流圖，并建立指紋圖譜。結果表明花椒揮發油相似度大于0.90，證明指紋圖譜建立的方法有效。說明不同產地的花椒揮發油既有一定相似性，又存在明顯差異。茂縣與武都大紅袍相似度在0.929～0.992，揮發油含量在2.8%～6.7%，兩者跨度較大，可能是由于采收季節時間、保存方式等的不一樣導致。聚類分析、主成分分析結果表明不同產地花椒揮發油成分之間存在差異，該結論與課凈璇等的研究結果一致[8]。

本研究以當前為主流市場品種的漢源花椒、武都花椒以及茂縣花椒的10批樣品進行GC-MS指紋圖譜研究及相似度評價，共標定了23個共有峰。聚類分析與主成分分析結果發現，漢源貢椒歸為一類；茂縣與武都花椒二者聚為一類，可能是由于兩地的花椒品種均為大紅袍，在地理上具有一定的相似性。漢源花椒被列為皇室貢品1000余年，成為中國進貢史長之最，漢源花椒依然是我國品質最好的花椒之一。漢源花椒土壤條件以黃棕壤為主，海拔在1100～1800 m。隴南大紅袍花椒主要分布于武都、文縣、舟曲等地，隴南武都區光熱資源豐富，氣候十分適合花椒生長，被冠以“千年椒鄉”[9-10]，花椒果實迅速膨大，椒皮鮮紅，油腺多而密，麻味重，粒大飽滿，香氣濃郁，品質特異，被稱為“大紅袍”。而茂縣干旱河谷地區晝夜溫差大的獨特氣候條件，塑造了茂縣特有的“大紅袍”花椒鮮紅透亮、麻味素含量高的特征。武都、茂縣花椒產地范圍內海拔900～2600 m，土壤為砂壤土，土壤pH值6.5～7.5。茂縣與武都地理環境均適宜“大紅袍”品種的栽種，故在本實驗中采集的大紅袍樣品出現了聚為一類的現象。

花椒作為高級調味香料和其深加工產品，其揮發性香味成分不僅是作為香原料的重要考察指標，也是構成和影響其加工產品質量的重要因素[11]。目前，花椒質量等級按照林業行業標準(LY/T 1652-2005)、國標GB/T 30391-2019等分級，主要包括感官評價和理化指標評價，其中感官指標包括色澤、氣味、味道和果形特征等，理化指標則以揮發油含量為主[12]。本研究建立了基礎指紋圖譜數據的花椒整體質量評價的方法，可找出質量影響較大的差異性成分，為后續選擇指標性成分進行含量測定來評價花椒質量優劣與揮發性成分相關性研究奠定了理論與實驗基礎。同時不同產地商品的花椒揮發油中Germacrene D、(+)-delta-Cadinene、Caryophyllene、Geranyl acetate、Linalool、α-Terpinyl acetate、(E,Z)-2,6-Dimethylocta-2,4,6-triene、trans-β-Ocimene、Nerol和γ-Elemene的含量存在顯著差異，可作為不同產地花椒揮發油質量差異的主要共有峰。

花椒揮發油含有大量同分異構體，在分析過程中僅利用標準質譜庫檢索進行定性，容易出現誤判。對于一些常規GC-MS定性方法難以鑒別的化合物，采用保留指數法可以得到更準確的定性結果[13]，如：保留時間為10.147 min的色譜峰，通過NIST 14.L標準質譜庫檢索分析為γ-Terpinene、3-Carene，匹配度均為94，經查閱文獻[14]，γ-Terpinene的保留指數為1060，3-Carene的保留指數為1007，與實測值進行比較，可知該化合物為γ-Terpinene。通過質譜庫檢索結果結合保留指數法，可準確性判斷花椒揮發油中的化學成分包括順反式以及α，β，γ等各種同分異構體。

由于花椒產地較多，本研究僅收集到部分產地的花椒品種，研究結果也僅能說明漢源、武都以及茂縣花椒揮發性成分的初步特征及差異，后期還需收集足夠多代表性的樣品，進一步驗證該實驗結果。本研究建立的花椒揮發油指紋圖譜對花椒的質量控制有積極意義，所含揮發性共有成分含量存在明顯差異，可為花椒品種選育和其在醫藥、食品、調味品等行業中的應用提供科學依據。