三種原料對種曲微生物種類及變化影響研究

李 銳，章 剛，張 磊，楊 強，劉源才，陳申習

（勁牌有限公司 勁牌研究院 中藥保健食品質量與安全湖北省重點實驗室，湖北 大冶 435100）

綠衣觀音土曲又名土曲、南曲，是湖南、湖北兩地普遍用來釀制小曲酒的酒曲[1]。制作原料主要包括大米、油糠、觀音土和種曲。而種曲是以大米、觀音土和曲母為原料制成，將原料加水拌勻之后制成曲坯料，團好的曲坯料整齊排放在墊有糠殼的木制箱窩內，然后加蓋竹席，此步驟稱為入箱。入箱培養約24 h，即可出箱。將出箱的曲坯撿到墊有糠殼的竹盤上，竹盤架在竹盤架上，此時進入后熟階段，整個后熟階段培養4 d，分別稱為“一燒”、“二燒”、“三燒”和“四燒”。四燒結束后，種曲即制作完成，從曲房拿出，貯存在通風干燥的曲庫內。成品種曲呈圓餅狀，表面微黃且分布著許多褶皺[2]。

種曲作為制作土曲的種子，其生產工藝及其含有的微生物數量及種類對土曲的質量有著最直接的影響。目前已發表的報道大多是關于大曲[3-4]或發酵酒醅[5]中的微生物，僅有少許文獻對土曲中的微生物及相關研究進行了報道[6-7]，而對種曲生產中的微生物種類及數量變化研究極少。目前種曲的生產采用較多的仍為早秈米，但存在質量不穩定，受氣候影響較大等問題。雜交糧和糯米作為常用的釀酒原料，它們所含有的營養物質相似，但各類成分含量又有所不同。作為微生物生長的培養基，釀酒原料對酒體風格有著直接的影響，而制曲原料同樣也會影響酒曲質量[8]。本研究采用稀釋培養法對三種原料（早秈米、雜交糧和糯米）制備的種曲樣品中微生物進行平板計數，并結合分子生物學方法對分離純化的菌株進行形態學觀察及分子生物學鑒定，對種曲制作過程中微生物變化情況進行了初步探究，為進一步優化種曲工藝并提升土曲質量提供了理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品材料

以早秈米、雜交糧和糯米為原料制備種曲：取自勁牌有限公司毛鋪制曲車間，每批種曲分別取入箱、出箱、一燒末、二燒末、三燒末和四燒末的樣品進行試驗。

1.1.2 化學試劑

土壤基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技有限公司；Primer Star Mix聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑：北京擎科生物科技公司；通用引物合成及測序由華大基因股份有限公司完成。其他試劑均為國產分析純。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）：去皮馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L，pH自然。121 ℃滅菌20 min。

孟加拉紅培養基：蛋白胨5 g/L，葡萄糖10 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，孟加拉紅0.033 g/L，瓊脂20 g/L，氯霉素0.1 g/L，pH自然。121 ℃滅菌20 min。

LB培養基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L、瓊脂20 g/L，pH自然。121 ℃滅菌20 min。

MRS培養基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏10 g/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖5 g/L，乙酸鈉5 g/L，檸檬酸二胺2 g/L，吐溫80 1 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，七水硫酸錳0.05 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，瓊脂20 g/L，pH 6.8。121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

5804R型離心機：德國Eppendorf公司；T100型PCR儀：美國Bio-Rad公司；ZQPW-70型恒溫搖床、SMI 12-2型恒溫培養箱：天津Labotery公司；1-14型高速離心機：美國Sigma公司；DW-86L 626型超低溫保溫箱：青島海爾特種電器有限公司；YX-280D型手提式高壓蒸汽滅菌器：合肥華泰醫療設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 含水量測定

采用常壓105 ℃烘箱干燥法[9]測定種曲樣品含水量。

1.3.2 平板計數

利用密封式粉碎機將酒曲樣品粉碎后過20目篩，稱取10 g至干凈的錐形瓶中，加入90 mL無菌水，混合均勻后置于30℃條件下振蕩培養30 min，然后取1 mL上清液至9 mL試管中，每次稀釋10倍至適當的梯度。取適量菌液，酵母菌計數采用PDA培養基涂布，霉菌計數采用孟加拉紅培養基涂布，細菌計數采用LB培養基涂布，乳酸菌計數采用MRS培養基傾注法。真菌培養基放置在30 ℃培養箱、細菌培養基放置在37 ℃培養箱進行培養，每隔一段時間觀察菌落生長情況，72 h后計算菌落數量，并結合含水量數據換算成干樣品中的含菌數（CFU/g）[10]。

1.3.3 菌種分離及鑒定

菌株分離：挑取每種培養基上不同形態特征的菌落進行劃線，得到單菌落后制作甘油管保存，做好標記后放入-80 ℃冰箱中保存[11]。

菌種鑒定：利用土壤基因組DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA。以此為模板，細菌采用細菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGT TACCTTGTTACGACTT-3'）[17]擴增其16S rDNA，PCR擴增體系：模板2μL、27F0.5μL、1492R0.5μL、PremixTaq15μL、雙蒸水（ddH2O）15 μL。PCR擴增程序：95 ℃3 min；93 ℃60 s，50 ℃60 s，72 ℃70 s；擴增進行30個循環；72 ℃10 min。真菌采用ITS通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）[12]擴增其內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）。PCR擴增體系：模板2 μL、ITS1 0.5 μL、ITS4 0.5 μL、PremixTaq酶15 μL、雙蒸水（ddH2O）15 μL。PCR擴增程序：95 ℃3 min；93 ℃60 s，55 ℃60 s，72 ℃70 s，30個循環；72 ℃10 min[13]。擴增產物送至華大基因測序。將測序得到的序列在美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）網站上比對，下載相似性較高的基因序列，再運用MEGA 6.0軟件序列比對，采用鄰接（neighbor joining，NJ）法繪制系統發育樹[14]。

2 結果與分析

2.1 種曲的感官及形態觀察

2.1.1 種曲的形態觀察

為了探究種曲外觀與原料是否有關，將烘干后的三種種曲（含水量≤5%）進行比對，結果見圖1。由圖1可知，早秈米制作的種曲質地疏松易碎，內部孔洞與其他兩種相比較多，表皮亦有孔洞，表面顏色微黃，內部呈米白色；雜交糧種曲質地較硬，內部孔洞較少，表皮有些許褶皺且無孔洞，表皮微黃，內部與早秈米相比顏色較黃；糯米種曲質地疏松易碎，內部孔洞較少，表皮有些許褶皺且無孔洞，表皮微黃，內部與早秈米相比顏色較白。由此可見，種曲內部顏色與原料顏色直接相關，而經過烘干的成品曲由于大量水分的散失，質地均疏松易碎。

圖1 三種原料制作種曲形態對比Fig.1 Comparison of the appearance of three seed Qu made with different raw materials

2.1.2 含水率

采用常壓105 ℃烘箱干燥法對種曲樣品含水量進行測定，結果見圖2。由圖2可知，3種種曲生產過程中的含水量變化一致，均為入箱時最高，在箱床培養階段含水量維持穩定，出箱后含水量開始逐步下降，直至四燒結束。但是整體而言，糯米種曲含水量最高，雜交糧種曲其次，早秈米種曲含水量最低。

圖2 三種不同原料種曲含水量在生產過程的變化Fig.2 Changes of water contents in three seed Qu made with different raw materials during production process

2.2 不同原料種曲制作過程中各類微生物數量變化情況

2.2.1 酵母菌數變化情況

采用孟加拉紅瓊脂培養基對酵母菌數進行檢測，為了使變化情況更加直觀，將計數結果轉換為10的對數，結果見圖3。由圖3可知，三種不同原料制作的種曲中酵母菌數變化趨勢相似。在前期及中期，酵母菌利用霉菌分解的營養成分大量繁殖。在箱床培養階段，酵母菌數總體增長較快，達到108CFU/g。出箱到一燒期間，酵母菌數基本維持穩定。一燒到三燒之間，三種種曲的變化趨勢出現差異，早秈米種曲和雜交糧種曲在一燒到二燒時酵母菌數快速增長分別達到4.7×109CFU/g和6.2×109CFU/g而后下降，而糯米種曲酵母菌數在此期間穩定增長在三燒時達到1.2×109CFU/g。三燒到四燒期間三種種曲的酵母菌數均出現回落。

圖3 三種不同原料種曲中酵母菌數在生產過程的變化Fig.3 Changes of yeast counts in three seed Qu made with different raw materials during production process

2.2.2 霉菌數變化情況

采用PDA固體培養基對種曲生產過程中霉菌數進行檢測，同樣將計數結果轉換為10的對數，結果見圖4。由圖4可知，三種不同原料制作的種曲中霉菌數變化趨勢相似。整個過程中霉菌數約為104～105CFU/g。入箱時霉菌數約為105CFU/g，二燒之前由于酵母菌生長利用了較多營養物質，與霉菌生長形成競爭關系，導致霉菌數持續減少，這個期間早秈米種曲中的霉菌數最多，其次是雜交糧種曲，糯米種曲中最少。3種種曲霉菌數在二燒末達到最低點，約為104CFU/g。二燒之后酵母菌數量不再增長，3種種曲霉菌數呈現上升趨勢，在四燒時最高，早秈米為1.7×105CFU/g、雜交糧為2.3×105CFU/g、糯米為4.2×105CFU/g，但由于受到酵母菌抑制，數量仍然較低。

圖4 三種不同原料種曲中霉菌數在生產過程的變化Fig.4 Changes of mold counts in three seed Qu made with different raw materials during production process

2.2.3 細菌數變化情況

采用LB固體培養基對種曲生產過程中細菌數進行檢測，將計數結果轉換為10的對數，結果見圖5。由圖5可知，箱床培養階段，3種種曲中細菌數均大幅增長。出箱后，雜交糧種曲和糯米種曲中細菌數基本維持穩定，而早秈米種曲中繼續保持增長至與其他2種種曲相當的水平。一燒過后，糯米種曲與早秈米種曲中細菌數緩慢增長后保持穩定，而雜交糧種曲則表現出先增長后下降再保持穩定的趨勢。雜交糧種曲在二燒時細菌數最高，為2.4×1010CFU/g，糯米和早秈米種曲在三燒時細菌數最高，分別為7.1×109CFU/g和2.2×109CFU/g。

圖5 三種不同原料種曲細菌數在生產過程中的變化Fig.5 Changes of bacterial counts in three seed Qu made with different raw materials during production

2.2.4 乳酸菌數變化情況

采用MRS培養基對種曲生產過程中乳酸菌數進行檢測，將計數結果轉換為10的對數，結果見圖6。由圖6可知，早秈米種曲和糯米種曲中乳酸菌數變化趨勢相似：箱床培養與一燒階段增長迅速，從二燒階段開始增長速度開始減緩而后保持穩定。而雜交糧種曲中乳酸菌數量則是在箱床培養階段快速增長，在一燒過程中增長緩慢，在二燒三燒期間出現先增長后下降的趨勢，最后數量基本保持穩定。雜交糧種曲在二燒時乳酸菌數最高，為3.2×1010CFU/g，早秈米種曲在三燒時乳酸菌數最高，為4.9×109CFU/g，糯米種曲在四燒時乳酸菌數最高，為5.4×109CFU/g。

圖6 三種原料種曲生產過程中乳酸菌數量變化情況Fig.6 Changes of Lactobacillus counts of three seed Qu made with different raw materials during production

2.3 三種原料種曲中微生物的分離鑒定

2.3.1 酵母菌的分離及分子生物學鑒定

采用PDA培養基從三種種曲中共篩選得到酵母菌37株，其中早秈米種曲中共篩選得到12株，雜交糧種曲中共篩選得到13株，糯米種曲中共篩選得到12株酵母，具體結果見表1，其中代表菌株的遺傳進化樹見圖7。由表1可知，其中數量較多的幾種均有助于發酵：三葉酵母常被發現于葡萄酒中[15]，有助于葡萄酒的風味；庫德畢赤酵母是釀酒中的生香酵母，廣泛應用于發酵食品中，具有作為益生菌和代謝產生物乙醇的潛力[16-17]；莢復膜孢酵母可以產生顯著水平的細胞外淀粉酶和葡糖淀粉酶[18]。

圖7 基于18S rRNA序列酵母菌代表菌株的系統進化樹Fig.7 Phylogenetic tree of representative yeast strains based on 18S rRNA sequences

表1 不同種曲樣品中酵母菌鑒定結果Table 1 Identification results of yeast in different seed Qu samples

2.3.2 霉菌的分離及分子生物學鑒定

采用孟加拉紅培養基從三種種曲中共篩選到霉菌29株，其中早秈米種曲中共篩選到9株，雜交糧種曲中共篩選得到9株霉菌，糯米種曲中共篩選得到11株霉菌，具體結果見表2，其中代表菌株的遺傳進化樹見圖8。

表2 不同種曲樣品中霉菌鑒定結果Table 2 Identification results of molds in different seed Qu samples

圖8 基于18S rRNA序列霉菌代表菌株的系統進化樹Fig.8 Phylogenetic tree of representative mold strains based on 18S rRNA sequences

由表2可知，篩選得到數量最多的為橫梗霉（Lichtheimia ramose），具有較高的產酯酶活性，也是中低溫大曲的優勢菌[19-20]。數量較多的還有印度毛霉菌，有助于發酵過程中有機酸以及酯類物質的產生[21-22]。

2.3.3 細菌的分離及分子生物學鑒定

采用LB培養基和MRS培養基從三種種曲中共篩選到細菌（包含乳酸菌）60株，其中早秈米種曲中篩選到12株，雜交糧種曲中共篩選得到17株，糯米種曲中共篩選得到31株，具體結果見表3，其中代表菌株的遺傳進化樹見圖9。由表3可知，鑒定得到的細菌主要為芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和片球菌屬（Pediococcus），其中芽孢桿菌可產生豐富的淀粉酶和蛋白酶等[23-24]，而乳桿菌和片球菌乳桿菌的作用主要是產生乳酸、乙酸等有機酸，提供酸性的釀造環境，同時為其他發酵微生物提供營養物質和風味化合物的前體物質[25]。

圖9 基于16S rRNA序列細菌代表菌株的系統進化樹Fig.9 Phylogenetic tree of representative bacteria strains based on 16S rRNA sequences

表3 不同種曲樣品中細菌鑒定結果Table 3 Identification results of bacteria in different seed Qu samples

3 結論

通過對三種不同原料種曲制作過程中微生物數量變化進行計數分析，結果表明，3種種曲中酵母菌、細菌、乳酸菌均呈上升趨勢，早秈米和雜交糧種曲酵母菌數二燒時最高，分別為4.7×109CFU/g和6.2×109CFU/g，糯米種曲酵母菌數三燒時最高，為1.2×109CFU/g；雜交糧種曲在二燒時細菌數、乳酸菌數最高，分別為2.4×1010CFU/g和3.2×1010CFU/g；3種種曲中霉菌數二燒之前持續下降，二燒時最低，早秈米為3.8×104CFU/g、雜交糧為7.1×103CFU/g、糯米為7.5×103CFU/g，二燒之后持續上升，并在四燒時最高，早秈米為1.7×105CFU/g、雜交糧為2.3×105CFU/g、糯米為4.2×105CFU/g。采用平板劃線法對三種原料制作的種曲中微生物進行純化鑒定，得到細菌、酵母及霉菌共126株，大多數都有助于乙醇發酵或白酒風味物質的產生。其中以早秈米為原料的種曲中共篩選到33株菌，其中包括4種酵母菌，4種霉菌和3種細菌。以雜交糧為原料的種曲中共篩選到39株菌，其中包括5種酵母菌，3種霉菌和5種細菌。以糯米為原料的種曲中共篩選到55株菌，其中包括3種酵母菌，5種霉菌和8種細菌。

本研究揭示了三種原料制作種曲過程中微生物數量變化規律，并純化得到126株菌株，為探究種曲工藝及其微生物在土曲制作中的功能及其品質提升奠定了基礎。