植物乳桿菌發酵棗汁在冷藏期間的營養品質變化研究

高昕瑜，吳彩云，李天琳，辛 磊，李 波，雷宏杰*

（1.西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西千裕酒業有限公司，陜西 寶雞 722301）

紅棗又稱大棗，鼠李科（Rhamnaceae）棗屬（Zizyphus），是原產于我國的特色樹種[1]。國家統計局數據顯示，2019年我國紅棗產量高達746萬t，近20年增長了4.7倍。紅棗產量的快速增加與精深加工技術的缺乏導致了紅棗價格暴跌[2]。因此，探索紅棗精深加工技術，豐富紅棗產品種類，提高紅棗附加值和經濟效益，是紅棗產業未來發展的大勢所趨。近年來，益生菌發酵果蔬汁飲料引起了人們的高度關注。以果蔬汁為發酵基質，經益生菌發酵而得的果蔬汁飲料，不僅營養美味，而且具有多種生理功能，迎合了素食主義者、乳糖不耐受和高膽固醇人群的特定需求[3-4]，具有良好的市場發展前景。

近年來，國內外研究人員在果蔬汁發酵及冷藏方面做了大量研究，探討了多種果蔬汁的益生菌發酵和冷藏過程的理化特性及生物活性變化。果蔬汁通過發酵獲得了更佳的營養特性，由于果蔬汁中的生物活性成分在發酵過程中被益生菌轉化、降解形成新的化合物，從而賦予發酵果蔬汁新的營養功能特性。發酵果汁在貯藏過程中的成分變化是產品質量的重要限制因素[5-6]。如MANTZOURANI I等[7]用副干酪乳桿菌K5發酵石榴汁，探究了冷藏過程中揮發性化合物、抗氧化活性和總酚含量的變化，發現與未發酵石榴汁相比，發酵石榴汁在冷藏（4 ℃）3周后獲得了更好的感官品質。FILHO A等[8]評估了發酵可可汁在冷藏（4 ℃）條件下的益生菌存活情況，發現可可汁是適宜益生菌生長的良好基質，可在為期42 d的保質期內保持良好活力。

目前有關紅棗發酵產品的研究主要集中于紅棗酒和紅棗醋等傳統發酵食品，未見益生菌發酵紅棗汁飲品的研究報道。前期研究結果已證實，紅棗是一種適宜益生菌發酵的基質[9]，本研究主要探究發酵棗汁中植物乳桿菌在貯藏期間的存活能力，分析發酵棗汁在貯藏過程中植物化學特性、抗氧化能力和風味特征的變化，以期為益生菌發酵棗汁產品的冷藏工藝提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陜北木棗、新疆和田棗：分別購自陜西清澗和新疆和田；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）90（Lp90）：江蘇微康生物科技有限公司。

MRS培養基、苯酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、3,5-二硝基水楊酸、濃硫酸、鄰苯二甲酸氫鉀、福林酚、濃鹽酸、氯化鐵：國藥集團化學試劑有限公司；2-辛醇、甲醇、甲酸、乙腈和酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、表兒茶素、蘆丁、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、槲皮素、肉桂酸、環磷酸腺苷：北京索萊寶科技有限公司。以上試劑均為國產分析純或色譜純。

1.2 儀器與設備

CR-5型色彩色差儀：柯尼卡美能達公司；DYJX超低溫冰箱：鼎耀機械有限公司；GL-10MD大容量高速冷凍離心機：湖南湘儀儀器開發有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；LRH-250CL低溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；UV1800PC紫外可見分光光度計、LC-30A超高效液相色譜儀、LC-20A高效液相色譜儀、GCMS-QP2010 Ultra 氣相色譜-質譜聯用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化與擴大培養

取1 mL保存于-80 ℃甘油管中的植物乳桿菌菌液接種至10 mL MRS液體培養基中，于37 ℃活化培養24 h后，再取1 mL混合培養液接種至100 mL MRS液體培養基中進行擴大培養（37 ℃、12 h），離心（6 000 r/min、4 ℃、10 min）收集菌體并用無菌生理鹽水清洗2次，備用。

1.3.2 紅棗汁制備、發酵與冷藏

選取成熟、干燥、無霉變的紅棗，洗凈、破碎后浸泡至飲用水中（25 g/L），于40～50 ℃浸提4 h后，用尼龍布進行過濾，得到棗汁。用飲用水將棗汁的可溶性固性物含量調至10°Bx，用食品級NaHCO3調pH至5.0。將制備好的棗汁巴氏殺菌（80 ℃、10 min）后冷卻至室溫備用。將菌懸液接種（0.5 mL/L）至棗汁中于37 ℃發酵48 h，然后在4 ℃條件下貯藏28 d，每隔7 d取樣，離心后（6 000 r/min、4 ℃、10 min）進行分析檢測。發酵陜北木棗汁縮寫為MJLp，發酵新疆和田棗汁縮寫為HJLp。

1.3.3 理化指標測定

活菌數：采用標準平板計數法進行植物乳桿菌活菌數的測定；可滴定酸：采用酸堿滴定法測定，結果以乳酸含量表示；總糖、還原糖：采用苯酚-硫酸法測定，結果以葡萄糖含量計算。

1.3.4 有機酸測定

取1 mL樣品過0.45 μm水系濾膜。色譜條件[10]：色譜柱為Waters C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.01 mol/L KH2PO4-H3PO4（pH 2.7）與甲醇的混合物（97∶3，V/V）；洗脫程序為等濃度洗脫；流速為0.6 mL/min；紫外可見光譜檢測波長為210 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

1.3.5 環磷酸腺苷測定

棗汁中環磷酸腺苷的含量采用高效液相法測定[11]：取1 mL樣品過0.22 μm水系濾膜。測定條件：流動相為KH2PO4（0.02 mol/L，pH 2.7）與甲醇的混合物（90∶10，V/V）；洗脫程序為等濃度洗脫；流速0.2 mL/min；檢測波長254 nm；檢測溫度40 ℃；進樣量1 μL。

1.3.6 總酚、總黃酮測定

采用福林酚比色法測定棗汁中總酚含量[12]：將2 mL福林酚試劑（10%）添加至1 mL經稀釋過的棗汁中，后加入2 mL 75 g/L Na2CO3溶液振蕩1 min，避光反應40 min，于紫外波長760 nm處測定棗汁樣品的吸光度值，結果以沒食子酸當量（gallic acid equivalent，GAE）（mg GAE/L）表示。

采用AlCl3比色法測定棗汁中總黃酮含量[13]：將500 μL 50 g/L的NaNO2溶液和3 mL蒸餾水加入1 mL棗汁樣品中，振蕩1 min并靜置5 min，然后加入1 mL 100 g/L的AlCl3溶液，振蕩1 min并靜置5 min，再加入2 mL的2 mol/L NaOH溶液反應5 min，于紫外波長510 nm處測定棗汁樣品的吸光度值，結果以蘆丁當量（rutin equivalent，RE）（mg RE/L）表示。

1.3.7 抗氧化能力測定

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力[14]：在1 mL稀釋后的棗汁樣品中加入2 mLDPPH甲醇溶液（45 mg/L）中避光反應30 min，于紫外波長517 nm處測定吸光度值，結果以DPPH自由基清除率（radical scavenging activity，RSA）表示。公式如下：

式中：Acontrol為空白組的吸光度值；Asample為樣品組的吸光度值。

鐵離子還原力（ferricion reducing antioxidant power，FRAP）[15]：將1 L醋酸鹽緩沖液（0.3 mol/L，pH 3.6）、100 mL 2,4,6-三吡啶基三嗪（2-4-6-tris（2-pyridyl）-s-triaz，TPTZ）溶液（0.01 mol/L）和100 mL FeCl3（0.02 mol/L）混合并在37 ℃反應30 min得到FRAP工作液。將0.2 mL樣品與6 mL FRAP工作液混合并在37 ℃反應30 min，于紫外波長593 nm處測定吸光度值，以Trolox為當量，樣品的Fe3+還原能力為mmol Trolox/L。

1.3.8 單體酚測定

參照WU C等[16]的方法進行測定。

1.3.9 風味物質測定

采用GC-MS對棗汁樣品中的風味物質進行測定[17]：將8 mL棗汁和2 g NaCl加入20 mL頂空瓶中，以2-辛醇作為內標物，加蓋密封后上機待測。通過與譜庫中標準品的保留時間和質譜進行風味物質的定性分析，保留指數（retention index，RI）＞85的結果，通過內標物濃度進行定量分析。

1.3.10 數據處理與分析

數據結果以3個獨立試驗的“平均值±標準差”表示。利用Minitab 18、SPSS 18和OriginPro 9.0軟件對數據進行統計匯總、顯著性分析（P＜0.05）和圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌發酵棗汁冷藏過程中理化指標的變化

由圖1A可以看出，植物乳桿菌在兩種棗汁中生長良好，發酵結束時活菌數均高于10.8 lg（CFU/mL）。冷藏過程中棗汁中活菌數逐漸減少，可能是由于發酵后棗汁內部酸性與外界低溫的環境條件抑制了菌體的生長，甚至導致菌體損傷和死亡[18]。冷藏28 d后棗汁中活菌數降至6.9 lg（CFU/mL），雖然在冷藏28 d后發酵棗汁的活菌數略低于最初接種量7.5 lg（CFU/mL），但仍高于聯合國糧食及農業組織（food and agriculture organization of the united nations，FAO）/世界衛生組織（world health organization，WHO）國際食品法典委員會（codex alimentarius commission，CAC）推薦的最小值6.0 lg（CFU/mL）[3]，說明冷藏28 d后的發酵棗汁仍可發揮其促進機體健康的作用。

圖1 植物乳桿菌發酵棗汁冷藏期間理化指標變化Fig.1 Changes in physicochemical indices of jujube juice fermented by Lactobacillus plantarum during refrigeration storage

由圖1B～圖1D可以看出，在冷藏28 d之后，發酵木棗汁的總糖含量與還原糖含量分別為74 g/L和61 g/L，相較冷藏前的發酵木棗汁降低了11.6%和10.4%；發酵和田棗汁的總糖含量與還原糖含量分別為67 g/L和45 g/L，相較冷藏前的發酵木棗汁降低了4.5%和14.5%，說明在冷藏過程中植物乳桿菌仍在緩慢進行代謝[19]。與未發酵棗汁相比，發酵棗汁中的可滴定酸含量顯著增加，在冷藏28 d之后，發酵木棗汁與和田棗汁的可滴定酸含量分別為3.3 g/L和3.4 g/L，相較冷藏前的發酵棗汁分別增加了3.5%和5.9%。

2.2 植物乳桿菌發酵棗汁冷藏過程中酚類物質含量及抗氧化活性的變化

由圖2A、圖2B可知，與未發酵棗汁相比，發酵棗汁總酚含量顯著增加，總黃酮含量顯著降低（P＜0.05），發酵后的木棗汁與和田棗汁總酚含量分別為1.10 g GAE/L和1.11 g GAE/L，相較未發酵棗汁分別增加了7.8%和6.7%；總黃酮含量分別為220 mg RE/L和162 mg RE/L，相較未發酵棗汁分別降低了14.1%和15.6%。在冷藏過程中，發酵木棗汁和發酵和田棗汁的總酚含量均在冷藏21 d時達到最低，分別為1.01 g GAE/L和0.98 g GAE/L，相較冷藏前的發酵棗汁降低了8.2%和11.7%；發酵木棗汁的總黃酮含量在冷藏7 d時達到最低，為205 mg RE/L，相較冷藏前的發酵棗汁降低了6.8%，發酵和田棗汁的總黃酮含量在冷藏21 d時達到最低，為127 mg RE/L，相較冷藏前的發酵棗汁降低了21.6%。冷藏結束后兩種棗汁的總酚含量和總黃酮含量均高于未冷藏的發酵棗汁，主要是由于植物乳桿菌具有去糖基化和從植物細胞壁釋放可溶性共軛或不溶性結合酚類化合物的能力，在冷藏過程中植物乳桿菌代謝產生的糖苷酶將大分子酚類化合物水解成活性更高的小分子酚類化合物[20-21]。

圖2 植物乳桿菌發酵棗汁在冷藏期間總酚、總黃酮及抗氧化活性的變化Fig.2 Changes in total phenols,total flavonoids and antioxidant activity of jujube juice fermented by Lactobacillus plantarum during refrigeration storage

由圖2C、圖2D可知，發酵棗汁中的DPPH自由基清除率和鐵離子還原力相較于未發酵棗汁顯著增加（P＜0.05），說明植物乳桿菌發酵可以提高棗汁的抗氧化活性。在冷藏過程中，兩種發酵棗汁的DPPH自由基清除率和鐵離子還原力呈動態變化的趨勢。發酵木棗汁和發酵和田棗汁的DPPH自由基清除率均在冷藏21 d時達到最高，分別為83%和86%，在冷藏28 d后兩種發酵棗汁的DPPH自由基清除率與冷藏前的發酵棗汁無明顯差異；在冷藏28 d后兩種發酵棗汁的鐵離子還原力達到最高，分別為2.7 mmol Trolox/L和2.3 mmol Trolox/L，與冷藏前的發酵棗汁相比分別提高了15.0%和8.9%。

由表1可知，發酵木棗汁在冷藏7 d時單體酚含量達到最高，為68.0 mg/L，發酵和田棗汁在冷藏28 d時單體酚含量達到最高，為59.2 mg/L。發酵木棗汁與發酵和田棗汁的沒食子酸、阿魏酸和蘆丁含量在冷藏過程中有所上升，而綠原酸含量有所降低；發酵木棗汁在冷藏過程中原兒茶酸含量有所增加，而發酵和田棗汁中原兒茶酸含量有所下降，可能是由于發生了脫羧反應將原兒茶酸代謝成兒茶酚[22-23]，在冷藏過程中，植物乳桿菌會水解并利用酚類化合物結合的糖類物質，從而產生空間位阻較低的游離苷元，進而影響棗汁中單體酚的組成與含量[24]。

表1 植物乳桿菌發酵棗汁冷藏過程中的單體酚含量Table 1 Free phenol content of jujube juice fermented by Lactobacillus plantarum during refrigeration storage

主成分分析（principal component analysis，PCA）被用來探究植物乳桿菌發酵不同棗汁在冷藏期間酚類物質變化與抗氧化活性之間的關系[25]。由圖3A可知，PC1可表示44.7%的變量，PC2可表示27.0%的變量，兩者共同解釋了71.7%的變量。由圖3B可知，未發酵棗汁、發酵木棗汁、發酵和田棗汁分別聚成三組。發酵木棗汁位于PC1的正向端，由載荷圖可知阿魏酸、肉桂酸、咖啡酸、沒食子酸和表兒茶素分布于PC1正向端，表明發酵木棗汁與上述單體酚之間存在正相關關系。發酵和田棗汁表現出更高的DPPH自由基清除能力。未發酵棗汁位于PC1的負向端，在載荷圖中槲皮素和對香豆酸分布于PC1負向端，表明未發酵棗汁與上述物質含量之間存在正相關關系。

圖3 植物乳桿菌發酵棗汁冷藏期間樣品主成分分析的分值圖（A）和載荷圖（B）Fig.3 Score figure (A) and loading diagram (B) of principal component analysis of jujube juice fermented by Lactobacillus plantarum during refrigeration storage

2.3 植物乳桿菌發酵棗汁冷藏過程中風味物質的變化

植物乳桿菌發酵棗汁中的風味物質是影響其感官品質的重要因素。如圖4所示，經聚類分析后的樣品被分為3簇，分別為未發酵棗汁、發酵木棗汁、發酵和田棗汁。在冷藏期間發酵棗汁中共鑒定出52種風味物質，其中包括12種醇類、11種醛類、9種酸類、12種酮類和8種酯類化合物。未發酵棗汁和發酵棗汁中最主要的風味物質均為酸類，其次為醛類、醇類和酮類，酯類含量最低。經植物乳桿菌發酵后，棗汁中的風味物質總含量顯著增加（P＜0.05），而冷藏后發酵棗汁中風味物質總含量顯著降低（P＜0.05），這與MANTZOURANI I等[26]報道的植物乳桿菌發酵石榴汁冷藏過程中風味物質含量的變化結果一致。

圖4 植物乳桿菌發酵棗汁在冷藏期間52種揮發性化合物（A）及各類揮發性香氣物質（B）的聚類熱圖Fig.4 Cluster heat map of 52 volatile aroma substances (A) and different kinds of volatile aroma substances (B) in jujube juice fermented by Lactobacillus plantarum during refrigeration storage

植物乳桿菌發酵木棗汁在冷藏28 d后，棗汁中風味物質總含量最低，為1.3 g/L，相較冷藏前的發酵棗汁降低了27.1%，而發酵和田棗汁的風味物質總含量則是在冷藏7 d后達到最低，為1.5 g/L，相較冷藏前的發酵棗汁降低了11.8%。冷藏后的發酵棗汁中最主要的醇類化合物是辛烯醇、苯甲醇和2-乙基己醇，這些醇類化合物可以賦予棗汁玫瑰花的香味。2,4-二甲基苯甲醛和壬醛是冷藏后的發酵棗汁中最主要的醛類化合物，壬醛具有柑桔的香氣，可以豐富棗汁的果味。兩種發酵棗汁冷藏后醛類化合物的含量都有所降低，冷藏后發酵棗汁中酸類化合物的含量相較于冷藏前發酵棗汁也有所降低，特別是發酵木棗汁。發酵棗汁中主要存在的酸類化合物是辛酸、己酸和乙酸，為棗汁增添了酸味。發酵棗汁在冷藏過程中乙酸的含量呈動態變化，主要是由于冷藏過程中乙酸既可以作為植物乳桿菌代謝產物，也可以作為合成酯類化合物的前體物質[27]。此外，發酵木棗汁在冷藏過程中辛酸含量有所增加，賦予棗汁奶酪的香味，發酵和田棗汁在冷藏過程中癸酸含量有所增加。酮類化合物與酯類化合物往往會使食品的氣味更加吸引消費者。發酵木棗汁中最主要的酮類化合物是乙偶姻，而發酵和田棗汁中最主要的酮類化合物則是2-庚酮和大馬士酮。在冷藏過程中發酵木棗汁的酮類化合物含量有所降低，主要是由于2-庚酮含量的減少，而發酵和田棗汁在冷藏后大馬士酮的含量有輕微增加，可能是由于植物乳桿菌代謝產生的糖基化酶切斷糖苷鍵進而形成了大馬士酮[28]。

冷藏過程中發酵棗汁的風味物質是不斷變化的，并且植物乳桿菌發酵棗汁香氣的形成和變化是一個復雜且動態的過程，雖然發酵棗汁在冷藏后揮發性化合物含量有所減少，但仍高于未發酵棗汁，發酵棗汁仍具有豐富的花香和果香。

3 結論

植物乳桿菌發酵棗汁在28 d的冷藏過程中活菌數逐漸減少，但28 d后仍滿足FAO/WHO推薦的能夠發揮健康作用的最小活菌數水平。在冷藏過程中，發酵棗汁的總酚含量有所升高，但總黃酮含量有所降低，DPPH自由基清除率和鐵離子還原力呈動態變化趨勢，但始終高于未發酵棗汁。經過冷藏后的發酵棗汁中風味物質總含量相較于冷藏前的發酵棗汁有所降低，但高于未發酵棗汁，28 d的冷藏過程維持了植物乳桿菌發酵賦予棗汁的花香和果香。