糯米酒的液態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化

閆曉雪，伍時華，吳 軍，龍秀鋒，牛福星，易 弋

（1.廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006；2.廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州 545006；3.廣西科技大學(xué)教育評價與教師發(fā)展中心，廣西 柳州 545006）

糯米酒是一種通過在底料中添加酒曲，利用其中糖化菌及酒化菌的代謝能力，在將糯米中的淀粉轉(zhuǎn)化為單糖并發(fā)酵為酒精的同時，將其中的多糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等物質(zhì)轉(zhuǎn)化為低聚糖、小分子有機(jī)酸、氨基酸及肽類物質(zhì)等對人體有益物質(zhì)的一種酒[1-3]。由于其酒精度含量低，口感香甜醇美，營養(yǎng)豐富，具有促消化、提神醒腦、消暑、增進(jìn)食欲和增進(jìn)血液循環(huán)等功效而深受人們喜愛[4-6]。糯米酒的食用方法除了可以直接飲用之外，還可以作為食品調(diào)味品來增加香氣、去腥除膻等[7-8]，在美食界備受關(guān)注。

傳統(tǒng)的糯米酒釀造方法是固態(tài)或半固態(tài)發(fā)酵[9-10]。但是該方法在對糯米原料蒸煮的環(huán)節(jié)中需要消耗大量的能量，導(dǎo)致制備成本過高。不僅如此，由于固態(tài)發(fā)酵本身的理化性質(zhì)因素影響，造成糯米發(fā)酵過程黏度不斷增大，局部溫度升高，發(fā)酵菌體分布不均勻等。其結(jié)果便造成了原料利用率下降，產(chǎn)率低，耗時長等不利于工業(yè)化應(yīng)用等影響。為此，在后續(xù)的研究中，利用液態(tài)發(fā)酵所固有的可調(diào)控，耗時短，原料利用率高等優(yōu)勢，進(jìn)行糯米酒工業(yè)生產(chǎn)成為了主要研究方向[11-12]。

糯米酒的產(chǎn)率及酒的品質(zhì)是工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的基礎(chǔ)。糯米酒液態(tài)發(fā)酵過程中的最重要發(fā)酵工藝（包括酒曲接種量、發(fā)酵溫度以及發(fā)酵時間）將一定程度上決定酒的產(chǎn)率，而酒的品質(zhì)鑒定也多體現(xiàn)在發(fā)酵過程中乙醇、乙酸乙酯及乳酸的量。為此，本研究以糯米為原料，通過添加酒曲進(jìn)行糯米酒的液態(tài)發(fā)酵。利用單因素及正交試驗(yàn)對糯米酒的液態(tài)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，在此優(yōu)化條件下進(jìn)行5 L發(fā)酵罐的放大實(shí)驗(yàn)，對該糯米酒的質(zhì)量指標(biāo)及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，為糯米酒的進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米：市售；安琪多糧酒曲：市售；乙酸乙酯、乙醇（均為色譜純）：上海凜恩科技發(fā)展有限公司；L-乳酸（分析純）：上海麥克林試劑科技有限公司；α-淀粉酶（酶活1.8×105U/mL）：滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZH-100KBS立式壓力滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；456GC氣相色譜（gas chromatography，GC）儀：荷蘭Scion Instruments公司；HITACHI高效液相色譜（high performance liquidchromatography，HPLC）儀：日本株式會社日立制作所；BIOSTATB25L發(fā)酵罐：德國Sartorius公司；ZXSD-R1430生化培養(yǎng)箱、ZWYR-C2402C恒溫培養(yǎng)振蕩器、ZHJH-C1112C超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司H2100R醫(yī)用離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；Therom TRACE1300 ISQQD氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糯米酒加工工藝流程及其操作要點(diǎn)

糯米打粉→加水調(diào)漿→加酶液化→滅菌→冷卻→加酒曲→液態(tài)發(fā)酵→離心→糯米酒成品

操作要點(diǎn)：

糯米打粉：挑選顆粒飽滿、無霉無蛀、淀粉含量高的糯米，機(jī)打成糯米粉，防潮保存?zhèn)溆谩?/p>

加水調(diào)漿：糯米粉與水按照質(zhì)量比1∶3攪拌均勻。

加酶液化：以10 U/g糯米粉添加α-淀粉酶，在95 ℃水浴中液化100 min，與碘液反應(yīng)不呈現(xiàn)藍(lán)色，結(jié)束液化。

滅菌：121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

添加酒曲：待溫度冷卻到室溫，將酒曲加入冷卻到室溫的發(fā)酵培養(yǎng)基中，晃動瓶身，使其均勻。

液態(tài)發(fā)酵：發(fā)酵瓶采取透氣膜加牛皮紙的方式進(jìn)行封口包扎，放置搖床中，30 ℃、150 r/min條件下進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束經(jīng)離心后得上清液，即為糯米酒成品。

1.3.2 糯米酒感官評價

參考相關(guān)糯米酒評定方法及感官評分標(biāo)準(zhǔn)[13-16]，隨機(jī)組合10人作為感官評價小組，通過多糯米酒產(chǎn)品的色澤、口感、氣味和組織狀態(tài)分別進(jìn)行評測，統(tǒng)計(jì)結(jié)果取平均值。具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 糯米酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory scoring standards of glutinous rice wine

續(xù)表

1.3.3 糯米酒液態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

分別對糯米酒液態(tài)發(fā)酵中的酒曲接種量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、發(fā)酵溫度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）及發(fā)酵時間（4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d）3個因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，重復(fù)3次，以發(fā)酵液中的乙醇、乙酸乙酯、乳酸及殘總糖為評價指標(biāo)，考察各因素對糯米酒液態(tài)發(fā)酵的品質(zhì)影響。

（2）正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取顯著影響試驗(yàn)結(jié)果的酒曲接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）3個影響因素，進(jìn)行3因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)，對發(fā)酵液進(jìn)行乙醇、乙酸乙酯、乳酸的積累量的測定，重復(fù)3次，參考文獻(xiàn)中權(quán)重賦予方法[17-18]，按照這些物質(zhì)對米酒發(fā)酵的重要性，依次賦予權(quán)重0.8、0.1、0.1，根據(jù)公式（1-1）計(jì)算綜合得分，對糯米酒液態(tài)發(fā)酵工藝進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。正交試驗(yàn)因素與水平見表2。

表2 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation process optimization

式中：Y為綜合得分，分；X1為當(dāng)前因素下乙醇積累量，g/L；A1為所有因素中最大乙醇積累量因素的乙醇積累量，g/L；X2為當(dāng)前因素乙酸乙酯積累，mg/L；A2為所有因素中最大乙酸乙酯積累量因素的乙酸乙酯積累量，mg/L；X3為當(dāng)前因素乳酸積累量，g/L；A3為所有因素中最大乳酸積累量因素的乳酸積累量，g/L。

1.3.4 糯米酒5 L罐液態(tài)發(fā)酵放大試驗(yàn)

根據(jù)正交優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行糯米酒5 L罐液態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵主要參數(shù)設(shè)置酒曲接種量2%、發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間8 d，轉(zhuǎn)速200 r/min，通氣量80 mL/min。

1.3.5 分析檢測

乙醇含量測定采用氣相色譜法檢測，其色譜條件：起始溫度50 ℃，5 ℃/min升至80 ℃，保持5 min，再以20 ℃/min升至180 ℃。進(jìn)樣口溫度180 ℃，檢測器溫度210 ℃，進(jìn)樣量0.5 μL，分流比20∶1[19]。

乙酸乙酯含量測定采用氣相色譜法檢測，其色譜條件如下：初始溫度40 ℃，3 ℃/min升溫至70 ℃，保持3 min，再以10 ℃/min升至180 ℃，保持2 min，進(jìn)樣口溫度200 ℃，檢測器溫度230 ℃，進(jìn)樣量0.5 μL，分流比20∶1[20]。

殘總糖、總酸、氨基酸態(tài)氮含量：按照國標(biāo)GB/T13662—2018《黃酒》進(jìn)行檢測[21]。

乳酸含量測定采用高效液相色譜法檢測，其色譜條件：磷酸二氫鈉∶乙腈=99∶1（V/V）的混合溶液過濾后方可作為流動相使用，日立C18色譜柱（5 μm×250 mm×4.6 mm），柱溫30 ℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，二極管陣列檢測器（diode-array detector，DAD），波長范圍200～400 nm，監(jiān)測波長210 nm，采集時間10 min。

揮發(fā)性風(fēng)味化合物檢測采用GC-MS法。樣品前處理：取發(fā)酵結(jié)束的發(fā)酵液在12 000 r/min、4 ℃的條件下離心15 min，取上清液和二氯甲烷各30 mL置于搖床（100 r/min）萃取60 min，取下層溶液，再分別用20 mL、10 mL的二氯甲烷萃取2次后，合并有機(jī)相，收集下層溶液并減壓濃縮至5 mL，4 ℃冷藏備用。氣相色譜條件：程序升溫：40 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至180 ℃保持5 min，再以5 ℃/min升至240 ℃；進(jìn)樣口溫度280 ℃；氦氣（He）流速1 mL/min；進(jìn)樣量1 μL。質(zhì)譜條件：離子源溫度300 ℃；傳輸通道溫度280 ℃；電離方式為電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV；質(zhì)譜掃描范圍40～600 amu[22]。

定性定量分析：采用將檢測到化合物的質(zhì)譜與美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）14標(biāo)準(zhǔn)譜庫比對進(jìn)行定性，采用面積歸一化法計(jì)算糯米酒中各揮發(fā)性成分的相對含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.0、SPSS19.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酒曲接種量對糯米酒發(fā)酵的影響

酒曲接種量的不同可能造成發(fā)酵液中菌種達(dá)到穩(wěn)定期的時間不同，造成菌種對底物的利用率、乙醇產(chǎn)率以及形成風(fēng)味物質(zhì)的含量不同，影響糯米酒品質(zhì)。控制發(fā)酵溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min，發(fā)酵時間為7 d，酒曲接種量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的發(fā)酵條件下，進(jìn)行乙醇、乙酸乙酯、乳酸和殘總糖的測定，考察酒曲接種量對糯米酒液態(tài)發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 酒曲接種量對糯米酒液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物積累量和殘總糖的影響Fig.1 Effect of Jiuqu inoculum on liquid fermentation products accumulation and total residual sugar of glutinous rice wine

由圖1可知，隨酒曲接種量在0.5%～3.0%范圍內(nèi)的增大，乙醇和乙酸乙酯的積累量均呈現(xiàn)先增加再降低趨勢，乳酸的積累量呈現(xiàn)上升趨勢，殘總糖呈現(xiàn)下降趨勢。在酒曲接種量為2.0%時，乙醇、乙酸乙酯積累量達(dá)到最大，分別為86.88 g/L、126.09 g/L，乳酸積累量為6.8 g/L，殘總糖含量為5.25 g/L。乙酸乙酯是由乙醇和乙酸的相互作用下酯化反應(yīng)生成[23]。這是因?yàn)榻臃N量低時，菌種代謝繁殖速率降低，原料利用率較低，部分糖沒有被消耗完全，間接導(dǎo)致乙醇積累量較低，殘總糖含量較高；當(dāng)接種量大時，微生物數(shù)量過多，相互之間形成競爭關(guān)系。微生物生長對葡萄糖消耗量增大，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化為乙醇的葡萄糖減少，間接導(dǎo)致乙醇積累量低，乙酸乙酯積累量較低。綜和比較分析，確定最佳酒曲接種量為2.0%。

2.1.2 發(fā)酵溫度對糯米酒發(fā)酵的影響

發(fā)酵溫度的不同可能造成發(fā)酵液中菌種生長情況和發(fā)酵產(chǎn)物不同，影響菌種酶活和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而造成底物的利用率，乙醇產(chǎn)率及風(fēng)味物質(zhì)的含量不同，影響糯米酒風(fēng)味。控制酒曲接種量2.0%，轉(zhuǎn)速為150 r/min，發(fā)酵時間為7 d，發(fā)酵溫度分別為26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃的發(fā)酵條件下，進(jìn)行乙醇、乙酸乙酯、乳酸和殘總糖的測定，考察發(fā)酵溫度對糯米酒液態(tài)發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 發(fā)酵溫度對糯米酒液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物積累量和殘總糖的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on liquid fermentation products accumulation and total residual sugar of glutinous rice wine

由圖2可知，隨發(fā)酵溫度在26～34 ℃內(nèi)的升高，乙醇、乙酸乙酯、乳酸的積累量均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，殘總糖的變化呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢。這是因?yàn)闇囟冗^低有可能會抑制酒曲中微生物的酶活，影響其生長導(dǎo)致發(fā)酵不完全，從而影響部分糖轉(zhuǎn)化為乙醇，進(jìn)而影響乙酸乙酯和乳酸的含量較低。當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃時，乙醇、乙酸乙酯積累量達(dá)到最大，分別為88.53 g/L、123.36 g/L，乳酸積累量達(dá)到最大7.71 g/L，殘總糖含量為6 g/L。但是當(dāng)溫度過高會使乙醇和乙酸乙酯揮發(fā)，并且會影響生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、脫氧核糖苷酸、核糖核酸及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，這些同樣會抑制微生物的生長，導(dǎo)致乙醇，乙酸乙酯、乳酸含量的降低[24-25]。綜合比較分析后，確定最佳發(fā)酵溫度為30 ℃。

2.1.3 發(fā)酵時間對糯米酒主要成分積累量的影響

發(fā)酵時間的不同可能造成發(fā)酵液中菌體代謝產(chǎn)物的不同，從而造成底物的利用率，乙醇產(chǎn)率及風(fēng)味物質(zhì)的含量不同，影響糯米酒風(fēng)味。控制發(fā)酵溫度為30 ℃，接種量為2%，轉(zhuǎn)速為150 r/min，發(fā)酵時間分別為4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d的發(fā)酵條件下，進(jìn)行乙醇、乙酸乙酯、乳酸和殘總糖的測定，考察發(fā)酵時間對糯米酒液態(tài)發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵時間對糯米酒液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物積累量和殘總糖的影響Fig.3 Effect of fermentation time on liquid fermentation products accumulation and total residual sugar of glutinous rice wine

由圖3可知，隨發(fā)酵時間在4～9 d內(nèi)的增加，乙醇積累量呈現(xiàn)先增加后下降趨勢，當(dāng)發(fā)酵時間為5 d的乙醇積累量達(dá)到最大91 g/L；當(dāng)發(fā)酵時間為7 d時，此時乙醇積累量88.37 g/L，乙酸乙酯積累量124.37 g/L，乳酸積累量6.89 g/L，殘總糖含量為5 g/L。其原因可能是，當(dāng)乙醇發(fā)酵完成時，隨著發(fā)酵時間的延長，乙醇會揮發(fā)或轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，如與酸類結(jié)合生成酯類物質(zhì)，導(dǎo)致積累量下降[26]，殘總糖呈現(xiàn)下降趨勢；乳酸積累量一直呈現(xiàn)上升趨勢；乙酸乙酯的積累量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但下降趨勢不明顯。綜合比較分析后，確定最佳發(fā)酵時間為7 d。

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酒曲接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）為影響因素，以綜合評分為評價指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation process optimization

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results

由表3可知，發(fā)酵工藝條件的主次順序?yàn)榫魄臃N量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間；得到最佳發(fā)酵工藝條件組合為A2B2C3，即酒曲接種量2%，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間8 d。在此優(yōu)化工藝條件下，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到糯米酒乙醇含量91.04 g/L，乙酸乙酯含量127.94 mg/L，乳酸含量7.4 g/L，綜合得分為97.83分。

由表4可知，發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對結(jié)果均有顯著的影響（P＜0.05），酒曲接種量對結(jié)果有極顯著的影響（P＜0.01）。因此，在糯米酒的液態(tài)發(fā)酵工藝中，酒曲接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間這三個因素都要考慮。

2.3 糯米酒5 L罐液態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

在前期針對三角瓶的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，糯米酒形成過程中酒曲接種量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間已經(jīng)得到了優(yōu)化。在得出最佳條件后，對該條件進(jìn)行5 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)，同時對糯米酒樣品進(jìn)行了酒精度、總糖、pH值、總酸、氨基酸態(tài)氮和乙酸乙酯的測定，結(jié)果見表5。

表5 液態(tài)發(fā)酵糯米酒質(zhì)量指標(biāo)測定結(jié)果Table 5 Determination results of quality indexes of glutinous rice wine by liquid fermentation

由表5可知，糯米酒樣品的酒精度達(dá)到11.3%vol，總酸為4.80 g/L，pH值為4.37，殘總糖為2 g/L，氨基酸態(tài)氮為246.4 mg/L，乙酸乙酯為123.36 mg/L，均符合國標(biāo)GBT13662—2018《黃酒》中的標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 糯米酒液態(tài)發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)分析

利用GC-MS對糯米酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測定，其總離子流色譜圖見圖4，各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定結(jié)果見表6。

圖4 糯米酒液態(tài)發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of flavor compounds in liquid fermentation of glutinous rice wine analysis by GC-MS

表6 糯米酒液態(tài)發(fā)酵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS分析結(jié)果Table 6 Analysis results of volatile flavor compounds in liquid fermentation of glutinous wine analysis by GC-MS

續(xù)表

由圖4及表6可知，糯米酒中共檢測出揮發(fā)性風(fēng)味化合物36種，其中醇類8種，酯類11種，酸類7種，酮類3種，其他類7種。醇類如異丁醇具有酒精香、雜醇酒、皮革香，2,3-丁二醇具有甜味，除此之外β-苯乙醇具有玫瑰、花香；4-甲基-1-戊醇具有杏仁、烘烤香等。酯類化合物一般都具有果香，如乙酸乙酯具有果香、葡萄、櫻桃香；乙酸異戊酯具有香蕉香。揮發(fā)性酸類化合物主要為乙酸，與積累量最多的非揮發(fā)性的乳酸共同在酒體酸的滋味方面發(fā)揮著主要作用，同時還是乙酸酯類化合物的前體物。酮類化合物如2,3-丁二酮具有獨(dú)特的黃油、甜奶油、焦糖香氣；呋喃酮具有果香、焦香[27-30]。各種揮發(fā)性風(fēng)味化合物之間相互作用，使酒香氣趨于融合、協(xié)調(diào)，使糯米酒獨(dú)具風(fēng)格。

3 結(jié)論

糯米酒的發(fā)酵品質(zhì)由發(fā)酵工藝所決定。本研究通過單因素試驗(yàn)以及正交試驗(yàn)分析，確定了糯米酒液態(tài)發(fā)酵的最佳工藝條件為酒曲接種量2.0%、發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間8 d。在此最佳發(fā)酵工藝條件下，進(jìn)行微通氧5 L罐液態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，酒精度、總酸、氨基酸態(tài)氮、乙酸乙酯的積累量分別為11.3%vol、4.8 g/L、246.4 mg/L、123.36 mg/L，殘總糖為2 g/L，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共檢測出35種。綜合所得結(jié)果分析，糯米酒液態(tài)發(fā)酵具有可行性，且操作簡便，便于生產(chǎn)，為糯米酒液態(tài)發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)提供理論研究依據(jù)。