發酵結束后浸漬時間對葡萄酒香氣成分及感官品質的影響

張 娟，張海軍

（1.寧夏農業學校，寧夏 銀川 750021；2.寧夏青銅峽市葡萄酒產業協會，寧夏 青銅峽 751600）

在葡萄酒酒精發酵過程中，葡萄酒的風味受葡萄品種、產地、風土條件、釀造和陳釀工藝等因素的影響[1]。浸漬是干紅葡萄酒釀造的關鍵工藝之一，浸漬的方法和強度會影響干紅葡萄酒的口感、顏色與香氣品質。后浸漬工藝即在酒精發酵結束后對皮渣暫不進行分離，使葡萄酒在皮渣中繼續浸漬一段時間，通過延長浸漬時間，獲得更多的酚類物質。采用后浸漬工藝釀制的葡萄酒，可以更好地利用皮渣里的營養和風味物質，改善以往粗放型發酵工藝存在的原料利用率低、營養成分損失大等難題[2]。當葡萄成熟度好、糖分高，葡萄自身多酚類物質含量充足，優質單寧及花色素成分較豐富時，需要加強浸漬力度以使葡萄酒獲得更多的構成其口感骨架的成分[3]；但有些年份，特別是先天氣候及土壤因素限制，葡萄原料成熟后，糖分積累并不高，也需要加強浸漬，在追求葡萄酒結構平衡的同時，更注重色澤、香氣、風味和單寧質感。為了獲得需長期陳釀的葡萄酒，使之富含色素和單寧應延長浸漬時間。因為單寧在決定葡萄酒骨架結構的同時，與酒中花色苷結合也是決定陳釀型葡萄酒顏色的主要成分。加強浸漬的另外目的就是為了獲得葡萄酒復雜濃郁的香氣，香氣是葡萄酒的重要感官質量指標之一，對葡萄酒的風格和典型性具有決定性作用。香氣物質按照來源不同，主要分為品種香氣物質、發酵香氣物質和陳釀香氣物質，其中發酵香氣物質主要來源于酵母主導的葡萄糖代謝路徑[4]。發酵香氣物質中，酯類物質是主要的呈香物質，對果香有重要貢獻[5]。而后浸漬法釀造的葡萄酒香氣更加濃郁，總酚含量較優，對葡萄皮中花色苷的浸提作用明顯，總酸含量平衡，釀制的葡萄酒酒體更豐滿，更協調，品質更佳。

前人主要集中于葡萄酒冷浸漬、熱浸漬、二氧化碳浸漬方法的研究[6]，而對發酵結束后延長浸漬時間的研究及配套工藝處理研究較少。本研究設置了發酵結束后延長浸漬的三個時間梯度處理，發酵結束后酒精度12%vol的赤霞珠干紅葡萄酒延長浸漬時間10 d分離皮渣為處理1（C1），以同原料同工藝發酵結束后延長浸漬時間20 d分離皮渣的干紅葡萄酒（C2）和發酵結束后延長浸漬時間30 d分離皮渣的干紅葡萄酒（C3），采用頂空固相微萃取（headspacesolid phase microextraction，HS-SPME）結合氣相色譜-質譜聯用法（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）對不同處理及對照的香氣成分進行分析，檢測理化指標并進行感官質量評價，旨在探索發酵結束后延長浸漬時間的釀造工藝，從中選出最佳的浸漬方法，為釀造陳釀型高品質葡萄酒提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄原料：紅色釀酒品種赤霞珠，2020年9月28日采自寧夏賀蘭山東麓葡萄產區；原料糖度（以葡萄糖計）為220 g/kg，酸度（以酒石酸計）為7.70 g/kg。

F33活性干酵母、Lafase He Grand Cru果膠酶（果膠水解酶活力8 600 PGNU/g）、焦亞硫酸鉀（分析純）：拉弗德LAFFORT公司；沒食子酸（分析純）：美國Sigma-Aldrich公司；單寧酸（分析純）：上海山浦化工有限公司；乙酸乙酯（分析純）：煙臺遠東精細化工有限公司；無水硫酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、五水合硫酸銅、酒石酸鉀鈉（均為分析純）：廣東光華科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

TraceDSQ氣質聯用（gaschromatograph-massspectrometer，GC-MS）儀：美國Thermo Finnigan公司；TurboMatrix 350熱解吸儀：美國PerkinElmer公司；DB-Wax色譜柱（30mm×0.25 mm×0.25 μm）：美國安捷倫公司；聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）涂層覆蓋的攪拌棒（Twister）（10mm×0.5mm）：德國Gerstel公司；TU-1810型紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；PL303型電子分析天平：瑞士Mettler Toledo公司；BCD-160型低溫冰箱：青島海爾有限公司；DZK/W-D2型恒溫水浴鍋：北京永光明醫療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 酒樣處理

葡萄破碎后分別泵入1號、2號和3號發酵罐中（10 t），在泵送過程中，逐漸添加50 mg/L的焦亞硫酸鉀，每罐入料8.5 t，充分混勻后，立即加入果膠酶30 mg/L（用20 ℃純水按照1∶10比例活化15 min），將破碎葡萄醪溫度降至8 ℃，低溫浸漬4 d后，升溫至15 ℃[7]，接入200 mg/L F33活性干酵母（按照1∶10的比例在38 ℃純水中活化25 min），葡萄汁每天早中晚各循環一次，每次10 min，發酵溫度控制在26～28 ℃，直到殘糖降到4.0 g/L以下發酵結束后，工藝調整為每天只噴淋1次5 min，并將發酵罐內充入足量CO2保護，對1號罐發酵結束后延長浸漬10 d后分離到5 t儲酒罐中滿罐儲藏作為處理1（C1）；對2號罐發酵結束后延長浸漬20 d后分離到另一5 t儲酒罐中作為處理2（C2）；對3號罐發酵結束后延長浸漬30 d后分離到5 t儲酒罐中作為處理3（C3），所有酒款陳釀3個月后，對各處理和對照的葡萄酒進行理化指標測定，香氣分析和感官質量評價。

1.3.2 葡萄酒香氣成分提取

將5 mL發酵結束后酒樣酒精放入20 mL萃取瓶中，加入3.00 g NaCl和50 μL質量濃度為1.64 mg/L的2-辛醇溶液作為內標，密封好后置于40 ℃水浴，頂空萃取30 min后，GC-MS進樣解吸10 min。

1.3.3 頂空固相微萃取法

取10 mL樣品溶液置于15 mL的頂空瓶中，加入1 g NaCl攪拌混勻，置于水浴（45 ℃）中平衡10 min，插入萃取頭吸附45 min，隨后插入GC樣品進樣口，熱解吸5 min分析成分。

1.3.4 氣相色譜-質譜聯用法測定香氣物質含量

DB-Wax色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫：起始溫40℃，保持8 min，以5 ℃/min升溫至240℃，保持5 min；進樣口溫度230 ℃，分流比20∶1，進樣量1 μL；載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min。電子電離（electron ionization，EI）源，離子源溫度為230 ℃，四級桿溫度150 ℃，傳輸線溫度250 ℃，電子電壓70 eV，質譜掃描范圍m/z 35～500，溶劑延遲8 min，掃描速率0.2次/s。

定性分析：采用與標準香氣成分保留時間（retention time，RT）對比的方法結合美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）-11、Wiley及香精香料標準譜庫檢索比對結果進行揮發性香氣化合物定性分析。

定量分析：對于已有標準品的香氣化合物通過內標-標準曲線法進行定量，無標準品的化合物采用化學結構、官能團相似、碳原子數相近的標準物質進行半定量[8]。對香氣物質的測定不同處理采用一次性集中進樣，不設重復。

1.3.5 葡萄酒理化指標的測定

還原糖和總糖（以葡萄糖計）：采用直接滴定法；總酸（以酒石酸計）：采用NaOH滴定法測定[9]；揮發酸（以醋酸計）：采用水蒸氣蒸餾法測定[10]；酒精度：采用密度瓶法；游離SO2和總SO2含量測定：采用直接碘量法測定[10]；葡萄酒中總酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu比色法[11]，結果以沒食子酸當量計；單寧含量的測定采用Folin-Denis法[12]進行；總花色苷測定參照文獻[13-14]的方法：取0.5 mL酒樣，用pH=1.0的緩沖溶液定容至10 mL。室溫下平衡1.5 h，以蒸餾水為對照，在波長521 nm和700 nm處測定樣品吸光度值。用相同的方法測定樣品在pH=4.5的緩沖溶液中吸光度值。總花色苷質量濃度計算公式如下：

式中：A=（Amax-A700nm）pH1.0-（Amax-A700nm）pH4.5；MW=493.2 g/mol；DF為稀釋倍數；1為光程的厘米數；ε為摩爾消光系數=28 000，單位為L/（mol/cm）[11]。試驗均重復3次，結果以平均值±標準偏差表示。

1.3.6 感官評價

葡萄酒感官評價是由寧夏賀蘭山東麓葡萄產區釀酒師、品酒師等6人組成的經驗豐富的評價小組進行感官評價，方法參照周繼亙等[14-15]的方法略有修改：從0～8表示不同屬性的強度（屬性不明顯=0，屬性強烈明顯=8），從嗅覺、味覺和視覺等方面進行綜合評價。

1.3.7 統計分析

試驗數據采用單因素方差分析法分析，數據的基本統計分析采用Microsoft Excel 2013進行。

2 結果與分析

2.1 發酵結束后浸漬時間對干紅葡萄酒理化指標的影響

發酵結束后不同浸漬時間下干紅葡萄酒的理化指標測定結果見表1。從表1看出，發酵結束后不同延長浸漬時間的處理，各處理葡萄酒中殘糖均＜4.0 g/L，酒精度12.2%vol～12.5%vol，總酸含量6.0～6.3 g/L，游離SO2含量27.4～33.2 mg/L，總SO2含量93.1～110.4 mg/L，均符合國標GB/T 15037—2006《葡萄酒》，但不同處理間揮發酸的含量差異性顯著（P＜0.05），其中C3的揮發酸達到0.4 g/L，顯著高于C1和C2的揮發酸含量（P＜0.05）。這可能是延長發酵后浸漬時間，使得葡萄酒、皮渣及酒泥直接接觸時間過長，給微生物的活動創造了條件。C3在總花色苷、總酚和單寧含量與C1和C2相比差異性顯著（P＜0.05）。延長后浸漬時間，葡萄酒中總花色苷、總酚和單寧含量均顯著增加，葡萄酒中的縮合單寧主要來源于葡萄皮和種子，發酵過程中通過皮渣浸漬作用等進入葡萄酒中[16]，而酚類物質的含量和組成，對其色澤、口感及結構等感官特征起著決定作用[17]。同時，較多研究指出酚類物質還具有較高的生理活性，是構成葡萄酒抗氧化、預防疾病等功效的重要成分[18]。而延長后浸漬時間有利于葡萄中的花色苷、單寧和酚類物質進一步在葡萄酒中得到釋放。

表1 發酵結束后不同浸漬時間下干紅葡萄酒的理化指標Table 1 Physical and chemical indexes of dry red wines with different maceration time after fermentation

2.2 發酵后不同浸漬時間干紅葡萄酒香氣成分分析

發酵結束后不同浸漬時間處理，葡萄酒香氣物質種類和含量存在一定差異性，通過GC-MS分析葡萄酒香氣物質的種類和含量，不同處理間酒樣的香氣成分及含量分析見表2。

表2 發酵結束后不同浸漬時間下干紅葡萄酒揮發性香氣化合物GC-MS分析結果Table 2 GC-MS analysis results of volatile aroma compounds in dry red wines with different maceration time after fermentation

續表

2.2.1 醇類物質

從表2看出，C3處理的葡萄酒中，共檢測出醇類物質有14種，其中苯乙醇含量最高，其次為4-甲基-1-戊醇，苯乙醇是由苯丙氨酸代謝產生的，它是葡萄酒中重要的呈香物質，與其他成分之間存在增效的效果，具有獨特的紫羅蘭、丁香和玫瑰香氣，賦予葡萄酒濃郁優雅的風味特征，而4-甲基-1-戊醇使葡萄酒表現出醇香和甜香。因為醇類物質是影響葡萄酒香氣最重要的物質之一，主要來源于酵母發酵和氨基酸轉化[19]。C3的醇類物質比C2多檢出1種壬醇，比C1多檢出3種，分別是2-甲基-1-丙醇、壬醇和2-丁基辛醇，說明雖然通過人工在發酵罐中填充足量CO2進行保護，但每天1次皮渣噴淋，這可能造成葡萄酒從發酵結束后的厭氧環境轉化為有氧環境，因而改變了部分醇類的生化合成過程，同時，在C3處理的葡萄酒中檢測出的2-甲基-1-丙醇和壬醇，讓葡萄酒表現出酒精味、玫瑰花和柑橘的香氣，使得香氣更加的復雜醇厚，可能是雖然人為拉長了后浸漬時間，但葡萄酒的生理生化反應仍在進行當中。同時，從表2中可以看出，C3的醇類香氣物質含量明顯高于C2和C1處理的葡萄酒，可能是延長浸漬時間，通過酒精的萃取，能夠充分將葡萄中的芳香物質浸提出來。

2.2.2 酯類物質

葡萄酒中的酯類物質來源于葡萄漿果、脂肪酸氧化以及醇、醛和氨基酸的代謝合成[20]。從表2看出，C3的葡萄酒共檢測出酯類物質12種，比C2多2種，比C1處理多3種，而且不同處理在酯類物質種類和含量上差別較大，在感官特性上表現出更加豐富的香氣，特別是在花果香氣、蜂蜜和蠟質香氣上，C3的含量最高，C2次之，C3處理的葡萄酒表現更加突出。從表2看出，不同處理間乙酸乙酯含量最高，使葡萄酒表現出新鮮的花果香氣，其次是乳酸乙酯，葡萄酒表現出果香和奶油香氣。其中，C3處理的葡萄酒乙酸乙酯檢測含量達到87 851.52 μg/L，是C2的1.1倍，是C1的1.3倍。在C1處理中未檢出丁酸烯丙酯、異戊酸乙酯和辛酸異戊酯，在C2中未檢出異戊酸乙酯和辛酸異戊酯，C3處理葡萄酒中的酯類物質更加多樣，香氣更加復雜，可能是因為該處理讓葡萄果皮中芳香類物質充分提取出來，從而提高了葡萄酒的品種香氣，延長后浸漬時間能夠萃取更多的酯類物質，延長了酯化反應的進程，同時，延長發酵后期浸漬時間，可能促進葡萄果實糖苷的酸解，賦予葡萄酒濃郁的花香和水果香。

2.2.3 酸類物質

從表2看出，實驗中C3處理的葡萄酒共檢出6種酸類物質，其中，C3的葡萄酒中癸酸物質含量最高達到123 292.36 μg/L，是C2處理的1.1倍，是C1處理的1.4倍，在葡萄酒中表現出脂肪和奶香，其次是月桂酸的含量較高，在葡萄酒中表現出月桂油香。葡萄酒中酸類物質主要來源于發酵副產物和葡萄漿果[21]。因為延長皮渣浸漬時間，C3的葡萄酒中乙酸含量達到1 932.52 μg/L，是C1處理的1.7倍，說明發酵結束后，人為延長后浸漬時間，而葡萄酒及皮渣中缺乏SO2的必要保護，也可能是延長浸漬促發了蘋果酸-乳酸發酵，致使葡萄酒中副產物乙酸含量增加。但壬酸在C2和C3處理的葡萄酒中未檢出，可能是因為浸漬時間延長，伴隨品溫緩慢降低，加上每天噴淋1次，使得一些酸類物質在長時間的后浸漬過程中造成逸散，而己酸、辛酸、癸酸和月桂酸等脂肪酸都具有明顯的脂肪味，對葡萄酒的味感平衡具有調節作用，共同提升了葡萄酒的整體結構。

2.2.4 酮類物質

從表2看出，酮類物質在各處理中均檢測出4種，其中C3的葡萄酒中3-羥基-2-丁酮含量最高，達到5 298.11 μg/L，在葡萄酒中表現為奶香，其次是3-己酮，在C3處理中含量高達1 779.28 μg/L，是C2處理的1.7倍，是C1處理的3.1倍，在葡萄酒中表現為果香和甜香，延長后浸漬時間能夠增加葡萄酒中酮類物質的含量，并賦予赤霞珠干紅葡萄酒風格迥異的風味特征。

2.2.5 醛類物質

從表2看出，只在C2和C3中檢測出1種醛類物質苯甲醛，C3的葡萄酒中苯甲醛質量濃度為109.72 μg/L，是C2處理的1.3倍。不同后浸漬時間處理檢出的苯甲醛，在葡萄酒中表現出苦杏仁味，對香氣有一定貢獻[22]，增加了葡萄酒香氣的復雜性。

2.3 發酵后不同浸漬時間干紅葡萄酒香氣成分及含量比較

不同浸漬工藝赤霞珠干紅葡萄酒香氣成分及含量見圖1。由圖1可知，葡萄酒發酵結束后延長浸漬時間，各處理間葡萄酒的香氣種類及香氣物質濃度存在一定差異性。其中各處理葡萄酒在醇類、酯類、酸類、酮類及醛類物質的香氣濃度值C3最高，C1最低，各香氣組分種類數量依次降低。C3的主要香氣組分醇類香氣物質總含量達到382 755.68 μg/L，占總香氣含量的55.8%，酯類香氣物質總含量達到了166 854.47 μg/L，占總香氣含量的24.3%，酸類香氣物質含量達到128 384.8 μg/L，占總香氣含量的18.7%，均顯著高于C2和C1（P＜0.05），C3在香氣種類數量上比C1和C2都存在一定優勢。因此，發酵后延長浸漬時間能夠顯著增加葡萄酒的香氣種類和香氣質量濃度，提升葡萄酒的香氣復雜性及濃郁度。

圖1 不同浸漬工藝赤霞珠干紅葡萄酒香氣成分種類及含量Fig.1 Types and content of aroma components in Cabernet Sauvignon dry red wine under different maceration process

2.4 發酵后不同浸漬時間赤霞珠干紅葡萄酒感官評價

浸漬工藝是決定一款葡萄酒品質的重要因素，在葡萄酒發酵結束后延長浸漬時間所釀造的葡萄酒香氣種類多、含量高，顏色深，結構飽滿，同時富有層次和甜感，可能是因為葡萄皮和葡萄籽中芳香類物質、花色苷、單寧和甘油等在長時間酒精萃取下更容易浸出，從而使得葡萄酒的香氣、顏色和風味更有質感。葡萄酒香氣感官評價雷達圖見圖2。

圖2 不同浸漬工藝赤霞珠干紅葡萄酒感官評價雷達圖Fig.2 Radar map of sensory evaluation of Cabernet Sauvignon dry red wine under different maceration process

結果表明，C2與C1處理相比，通過延長后浸漬時間，能夠整體提升葡萄酒的品質，而C3處理的葡萄酒花香、果香和酯類香氣更加均衡、復雜，香氣質量和香氣濃郁度表現更加突出，葡萄酒在色澤、香氣、飽滿度、風味濃郁度和甜感上都要優于C2和C1處理，而且三個處理的葡萄酒均沒有明顯氧化味，這對于酒精度12%vol的干紅葡萄酒或者因發酵前期工藝處理不當而風味表現欠佳的干紅葡萄酒，在發酵結束后延長浸漬時間，能夠很好的修補葡萄酒的色澤、香氣及口感上的缺陷，讓葡萄酒表現的更加飽滿醇厚，從而大幅提升葡萄酒的整體風味。

3 討論

浸漬是釀造干紅葡萄酒的關鍵工藝之一，不同的浸漬工藝會影響葡萄酒中香氣物質的種類和含量，科學地選擇適宜的浸漬工藝有助于提高葡萄酒的香氣[3]。而發酵香氣物質主要來源于酵母主導的葡萄糖代謝路徑[3，23]。李運奎等[24]研究發酵過程中乙酸酯的生成動力學模型揭示，乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯的生成分別相對于異戊醇和苯乙醇有延滯效應，與本研究香氣檢測一致。目前多以研究葡萄酒發酵先進行冷浸漬或二氧化碳浸漬，然后再常規發酵葡萄酒，能夠提升葡萄酒的品質；而發酵結束后延長浸漬時間對葡萄酒品質影響的研究報道較少，本研究發現，發酵結束后大幅度延長浸漬時間，能夠顯著增加葡萄酒的色澤、香氣和單寧物質含量，能夠增強葡萄酒的甜感，讓葡萄酒更加富有層次和醇厚感，顯著提升葡萄酒的品質。商華等應用后浸漬工藝可對葡萄酒中酚類物質的增加起到促進作用，使葡萄酒口感更加濃郁[25]。與本研究結論一致。而且發酵結束后大幅延長浸漬時間的C3處理，在感官品嘗評價中并未發現酒體有浸漬過度造成酒體干澀，口感過于粗糙而導致葡萄酒品質下降等結果。這無疑對于氣候、土壤等因素導致因葡萄糖分不足，致使風味寡淡或者葡萄酒發酵前期工藝控制不當導致色澤、香氣及口感不足，通過發酵后延長浸漬時間及配套工藝調整對葡萄酒進行缺陷修補、品質提升是一種有意嘗試。

4 結論

本研究通過發酵結束后延長浸漬時間及配套工藝上的調整，對于酒精度12%vol的赤霞珠干紅葡萄酒，發酵結束后延長浸漬10 d分離皮渣的干紅（C1）和延長后浸漬時間20 d的干紅（C2）與延長后浸漬時間30 d的干紅（C3）在色澤、香氣和風味物質上存在差異性，特別是在醇類、酯類、酸類、酮類和醛類香氣成分含量上C3、C2均高于C1，在揮發酸、總花色苷、單寧和總酚等理化指標上差異性顯著，葡萄酒感官質量評價C3處理最佳，此處理具有水果香和植物香的香氣更加濃郁，葡萄酒表現出明顯的甜感，層次清晰，結構飽滿。在揮發酸和衛生條件有效控制的前提下，對于12%vol赤霞珠干紅，選擇最佳分離期應在發酵結束后浸漬皮渣30 d后分離。