基于系統生物學比較溫病“辛涼三劑”方證的病理機制差異*

胡莉，白辰，劉邵陽，龍超君，于河，谷曉紅，劉鐵鋼

北京中醫藥大學中醫學院 北京 100029

吳瑭·《溫病條辨》中分別稱桑菊飲、銀翹散、白虎湯為辛凉輕劑、辛凉平劑、辛凉重劑，其依據三方透邪外達力度而有輕、中、重程度之分。桑菊飲和銀翹散皆是辛凉解表之劑，白虎湯為清氣分熱的處方。但在透邪外達的作用上三者是一致的。用于衛分證的桑菊飲解表之力稍弱，主要為清肅肺氣、宣肺止咳，故稱辛凉輕劑；銀翹散辛透凉泄，透泄力介于桑菊飲和白虎湯之間，故稱辛凉平劑。《溫病條辨》言：“白虎本為達熱出表”，又稱：邪重，非其力不舉。可見白虎湯透邪力在三者中最強，因其辛透寒泄，大清氣分邪熱，故稱辛凉重劑。

辛凉輕劑桑菊飲證表征為咳嗽，身熱不甚，口微渴；其證質為肺失宣降，證治以宣肺為主。辛凉平劑銀翹散證表征為發熱，微惡風寒，無汗或有汗不暢，頭痛口渴，咳嗽咽痛；其證質為風熱邪氣侵襲肺衛、衛外失司，證治以泄衛為主。辛凉重劑白虎湯證表征主治壯熱面赤，煩渴引飲，汗出惡熱；其證質為肺胃熱熾，證治以清熱生津為主。三個方證方藥組合雖各有側重，然皆輕清突出。臨床孰去孰從，權在靈活。

隨著基因、蛋白、代謝組技術的發展，系統生物學——在于研究細胞信號傳導和基因調控網絡、生物系統組成之間相互關系的結構和系統功能的一門新學科順勢而生。以構建“表征（Symptoms）-基因（Targets/Genes）”網絡為方法，從改善或恢復生物網絡平衡的角度來認識方證生物學機制的比較，對生物系統網絡進行整體分析[1]。本研究用系統生物學方法，構建了“辛凉三劑”方證表征的“表征-基因-靶點”網絡，并對其進行基于功能與通路分析，借以闡述“辛凉三劑”方證證治的作用機制及差異。

資料與方法

1 一般資料

第七版《方劑學》[2]記載：“桑菊飲主治癥狀：咳嗽，身熱不甚，口微渴，脈浮數。銀翹散主治癥狀：發熱，微惡風寒，無汗或有汗不暢，頭痛口渴，咳嗽咽痛，舌尖紅，苔薄白或薄黃，脈浮數。白虎湯主治癥狀：壯熱面赤，煩渴引飲，汗出惡熱，脈洪大有力。”

2 數據庫及軟件

中藥靶點數據庫SymMap[3]（http://www.symmap.org），HPO數據庫[4]（https://hpo.jax.org/、PolySearch2文獻挖掘工具[5]（http://polysearch.cs.ualberta.ca/），蛋白質相互作用數據庫String[6]（https://string-db.org/），基因注釋和分析資源Metascape[7]（http://metascape.org）。網絡可視化工具 Cytoscape 3.7.2[8]。

3 “辛涼三劑”方證表征相關靶標基因獲取

本研究采用數據庫檢索與文獻挖掘兩種方式結合獲得“辛凉三劑”方證表征的相關靶標基因。利用SymMap數據庫、HPO數據庫、PolySearch2文獻挖掘工具，以桑菊飲證的“咳嗽”、“身熱不甚”、“口微渴”；銀翹散證的“發熱”、“微惡風寒”“無汗”、“頭痛”、“口渴”等；白虎湯證的“壯熱”、“面赤”、“大渴”、“大汗”等關鍵詞檢索“辛凉三劑”方證表征相關靶標基因后取其并集，去除重復基因及Uniprot數據庫[9]（http://www.uniprot.org/）中未經注釋的或不屬于人類的靶點，得到“辛凉三劑”方證表征對應的SymMap terms和HPO terms條目。并利用OmicShare[10]網站（http://www.omicshare.com/），把“辛凉三劑”方證表征靶標之間關系以韋恩圖展示。

4 靶點蛋白的生物功能分析

以String 數據庫作為背景網絡數據庫，分別將桑菊飲證、銀翹散證、白虎湯證的靶點蛋白導入，選擇研究物種為“Homo sapiens”，以0.95作為最低交互得分，以數據庫、實驗及文獻挖掘為網絡交互來源，構建“辛凉三劑”方證表征的有效靶點互作（Protein-Protein Interaction，PPI）網絡，保存為TSV格式文件。

5 網絡可視化與核心網絡構建

為了使網絡關系更為直觀，本研究應用 String 數據庫以TSV文件保存的結果在軟件 Cytoscape 3.7.2上構建“表征-基因”可視化網絡，并根據Degree值（連接度）調節節點的大小、顏色，以更直觀地呈現靶標之間的相互作用關系；并利用其MCODE拓展功能篩選核心網絡，選擇MCODE SCORE前三的核心網絡，并記錄其Node和Edge值。

6 基因功能和通路富集分析

利用MetaScape平臺，從“辛凉三劑”方證的“表征-基因”網絡中選取MCODE 得分最高的第一聚類相關基因進行分析，將預測靶標基因上傳至David數據庫（https://david.ncifcrf.gov/），進行GO富集分析[選擇生物過程，分子功能和細胞組成3個模塊]和KEGG通路分析。利用 Cytoscape 的 MCODE 功能篩選基因功能和通路的核心網絡，篩選出Pvalue<0.001的通路，并根據其上富集的基因數進行降序排列，選取排名前20的通路，使用OmicShare網站（http://www.omicshare.com/）將結果以高級氣泡圖的形式展現。

結 果

1 相關基因檢索

針對桑菊飲證、銀翹散證、白虎湯證三個方證的表征，在中藥靶點數據庫SymMap、HPO數據庫上手動檢索了盡可能多的terms。例如，對于癥狀“發熱”，在中藥靶點數據庫SymMap中通過“發熱”進行檢索；通過關鍵字和其他同義詞（例如“Recurrent fever”）搜索了HPO數據庫，并找到了三個具有相似含義的HPO術 語：“Fever”（HP:0001945），Recurrentfever（HP:0001954），Unexplainedfevers（HP:0001955），Periodic fever（HP:0032323）。如表1-3所示，大多數表征有幾個對應的SymMap terms和HPO terms，而一些“有汗不暢”“身熱不甚”“惡熱”等表征未包括在數據庫中。

表1 桑菊飲證表征的相應terms

2 “辛涼三劑”方證靶標預測

經檢索桑菊飲證、銀翹散證、白虎湯證三個方證的表征，獲得Genes列表，并將桑菊飲證、銀翹散證、白虎湯證三個方證表征的相關靶標基因取其并集，去除重復基因及Uniprot數據庫中未經注釋的或不屬于人類的靶點。得到桑菊飲證表征涉及蛋白靶點244個，銀翹散證表征涉及蛋白靶點410個，白虎湯證表征涉及蛋白靶點172個。桑菊飲證、銀翹散證、白虎湯證表征的靶標基因的相互關系見圖1。

圖1 三方證映射靶標韋恩圖

表2 銀翹散證表征的相應terms

表3 白虎湯證表征的相應terms

Y1代表銀翹散證，y2代表桑菊飲證，y3代表白虎湯證。“辛凉三劑”方證表征共有的靶標基因有8個；銀翹散證和桑菊飲證表征中共有而白虎湯證中沒有的靶標基因有235個，銀翹散證和白虎湯證表征中共有而桑菊飲證中沒有的靶標基因有26個，桑菊飲證和白虎湯證表征中共有而銀翹散證中沒有的靶標基因為0個；桑菊飲證表征中有而白虎湯證和銀翹散證中都沒有的靶標基因有1個，銀翹散證表征中有而桑菊飲證和白虎湯證中都沒有的靶標基因有140個，白虎湯證表征中有而銀翹散證和桑菊飲證中都沒有的靶標基因有138個。

3 基因間互作關系分析

利用String 數據庫及Cytoscape網絡可視化工具構建“表征-基因”網絡，得到桑菊飲證表征基因間互作關系28個，銀翹散證表征基因間互作關系42個，白虎湯證表征基因間互作關系19個。利用Cytoscape將“表征-基因”網絡可視化并使用MCODE工具獲得該網絡的核心部分，各個網絡節點的大小由其連接度（相鄰網絡節點的數目）決定：節點越大尺寸越大則該節點連接度越高，具體見圖2-5。

4 方證通路GO富集結果

對三個方證的基因分別進行基因富集分析后，桑菊飲證獲得GO生物進程168個；銀翹散證獲得GO生物進程288個；白虎湯證獲得GO生物進程71個。三個方證涉及的生物學進程結構和相互關系基本相似，在GO生物進程可映射的基因上存在差異。桑菊飲證映射了27個基因、桑菊飲證映射了40個基因、桑菊飲證映射了19個基因。桑菊飲證和銀翹散證共有的基因有26個，為TNF、CCL2、CCR1、HP、IL10、BTK、ERCC5、ERCC3、HBB、ERCC4、BLNK、ERCC2、IL6、NCF2、NCF1、NCF4、HBA2、HBA1、STAT3、XPA、CYBA、CYBB、XPC、DDB2、CD79B、CD79A；銀翹散證和白虎湯證共有基因3個，為EDARADD、EDAR、EDA；桑菊飲證和白虎湯證無共有基因；桑菊飲證獨有的基因為CXCL8；銀翹散證獨有的基因為CHEK2、ERCC8、APP、APOA1、APOE、IL1B、THPO、TP53、BRCA2、JAK2、MPL；白虎湯證獨有的基因為HSP90AB1、ORAI1、HSP90AA1、STIM1、HSPA1B、ITPR2、TMEM67、HSPA1L、HSPH1、NPHP4、HSPA2、HSF1、HSPA4、DNAJB1、HSPA9、NPHP1。桑菊飲證、銀翹散證、白虎湯證在GO 生物過程經 MCODE 篩選后得到核心條目分別為18條、9條、7條。具體分析結果見圖6。

5 方證通路KEGG富集結果

經富集分析后，桑菊飲證獲得KEGG通路86個；銀翹散證獲得KEGG通路108個；白虎湯證獲得KEGG通路50個。三個方證共同涉及的信號通路18個；桑菊飲證和銀翹散證共有的信號通路有65個；銀翹散證和白虎湯證共有的信號通路有4個；桑菊飲證和白虎湯證無共有的信號通路；桑菊飲證獨有的信號通路有3個；銀翹散證獨有的信號通路有21個；白虎湯證獨有的信號通路有28個。

為了更加系統地分析目標靶點的生物學功能，我們運用KEGG的PATHWAY數據庫部分對目標靶點進行PATHWAY通路分析。得到桑菊飲證相關通路52條（P-Value<0.01），銀翹散證相關通路46條（P-Value<0.01），白虎湯證相關通路18條（PValue<0.01）。通過OmicShare平臺將分析結果轉化為高級氣泡圖（見圖7-9）。

圖3 銀翹散證的“表征（Symptoms）-基因（Targets/Genes）”網絡及核心模塊

圖4 白虎湯證的“表征（Symptoms）-基因（Targets/Genes）”網絡及核心模塊

圖5 “辛涼三劑”方證表征（Symptoms）的基因（Targets/Genes）網絡

圖7 桑菊飲證靶標的KEGG通路富集分析

在P-Value<0.01的桑菊飲證、銀翹散證、白虎湯證的富集通路分別有52條、46條、18條，其相互之間的關系如圖10。圖中所示，“辛凉三劑”方證表征共有的富集通路有5條，以NOD樣受體信號通路（NOD-like receptor signaling pathway）為主；銀翹散證和桑菊飲證表征中共有而白虎湯證中沒有的富集通路有36條，以細胞因子與細胞因子受體的相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction）、趨化因子信號通路（Chemokine signaling pathway）、B細胞受體信號通路（B cell receptor signaling pathway）、NF-κB信號通路（NF-kappa B signaling pathway）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）、TNF信號通路（TNF signaling pathway）為主；銀翹散證和白虎湯證表征中共有而桑菊飲證中沒有的富集通路為0條；桑菊飲證和白虎湯證表征中共有而銀翹散證中沒有的富集通路為1條，是EB病毒感染（Epstein-Barr virus infection）可能相關性疾病；桑菊飲證表征中有而白虎湯證和銀翹散證中都沒有的富集通路有10條，以T細胞受體信號通路（T cell receptor signaling pathway）為主；銀翹散證表征中有而桑菊飲證和白虎湯證中都沒有的富集通路有5條，以Jak-STAT信號通路（Jak-STAT signaling pathway）為主；白虎湯證表征中有而銀翹散證和桑菊飲證中都沒有的富集通路有12條，以MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）、鈣信號通路（Calcium signaling pathway）為主。

圖8 銀翹散證靶標的KEGG通路富集分析

圖9 白虎湯證靶標的KEGG通路富集分析

圖10 P<0.01的辛涼三劑方證的富集通路

討 論

辛凉三劑方證均為外感風熱病邪侵犯人體后不同的病變階段，故本篇旨在通過構建“辛凉三劑”方證表征-基因-通路網絡，探討溫病“辛凉三劑”方證的病理機制差異。《溫熱論》中“溫邪上受，首先犯肺”指出，由于肺主氣屬衛，與皮毛相合，衛氣敷布于皮毛，故風溫病邪外侵，肺衛首先受其影響，衛氣閉郁，肺氣失宣，故有發熱微惡寒，咳嗽等表現。肺衛之邪感邪不甚，經及時治療后可獲痊愈。若感邪較重，或肺衛之邪不解，則其可發為胃與心包的傳變邪熱在肺衛不解，由衛入氣，則順傳于胃，多呈陽明熱熾的病理表現：壯熱、汗出、口渴、苔黃燥、脈洪大等。此即“辛凉三劑”方證在風熱病邪侵犯人體后由外及內、順傳逆傳的傳變模式和病期特征。

桑菊飲證屬風熱病邪侵襲肺衛，病位主要在肺，肺主氣屬衛，鼻氣通于肺，衛氣被郁，肺氣失于宣暢，表現以咳嗽為主要癥狀。病勢表現為正盛邪微，故身熱不甚；病變初起津傷不甚則口微渴。銀翹散證與桑菊飲證同屬于衛分階段，邪犯肺衛，以衛氣閉郁為主要病機變化，病勢上正邪相爭故見發熱。衛氣閉郁，開合失常則見無汗或有汗不暢；頭為諸陽之會，衛氣郁阻，經氣不利而見頭痛；其與桑菊飲證病變同處于初期階段津傷不甚而口渴。白虎湯證的病變部位則是病邪加重由衛分傳變入氣分，臟腑病變部位在胃，病勢上正邪劇爭、里熱蒸迫而見壯熱惡熱，熱勢較前兩者加重；且熱盛于里迫津外泄而見大汗不已，熱盛傷津則燥渴引飲，其津傷程度較前兩者甚。

發熱是生物體在進化上高度保守的應對感染和損傷的防御機制，可以有效地激活免疫系統來清除病原體從而維持機體免疫穩態[11]。如圖11所示“辛凉三劑”方證的信號通路的異同，“辛凉三劑”方證共有NOD樣受體信號通路引發炎癥發生的發熱機制有目共睹，其中NOD1和NOD2在參與內質網應激誘導的炎癥反應中至關重要[12]。桑菊飲證與銀翹散證的共有信號通路中的Toll樣受體信號通路、NF-kB信號通路、B細胞受體信號通路、T細胞受體信號通路與Jak-STAT信號通路均為免疫與炎癥相關信號通路，可以通過免疫炎癥反應引起機體發熱。病原微生物等外致熱源入侵機體后，引發機體的天然免疫系統的模式識別受體則為Toll樣受體（TLRs）[13]，細胞漿 Toll/IL-1 受體（TIR）的結構域會激活TLR信號轉導通路[14]，該結構域與TIR結構域包含的接頭蛋白MyD88發生相互作用[15]。由Toll樣受體信號通路在中游激活NF-kB信號通路和MAPK信號通路后可在下游表達出發揮促炎作用的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和發揮趨化作用的IL-8、RANTES、MIP-1α、MIP-1β等炎性細胞因子[16-18]。IL-1β能夠影響適應性免疫反應和先天性免疫反應，影響T細胞的成熟和B細胞的增殖，此外還能促進炎癥分子（例如一氧化氮、磷脂酶A2、環氧合酶-2和前列腺素E2）的表達[19]。TNF-α是由單核吞噬細胞產生的多肽，是急性感染性疾病的炎癥過程和臨床表現的重要介質[20]。同時，在接觸外致熱源如肽聚糖的刺激后在Toll樣受體信號通路中可形成TLR1和TLR2的復合體作用于Rac1，后激活P13K-Akt信號通路，Akt可間接作用于NF-kB/Rel復合體而發生后續的反應。T細胞信號通路也可促進IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ、GMCSF、TNF-α、CDK4的細胞因子的表達，B細胞信號通路可促進細胞因子參與自身的免疫。

圖11 “辛涼三劑”方證主要通路機制的異同列舉（以KEGG通路編號形式展示）

由上，可發現辛凉三劑方證通過多通路誘導的免疫反應引起機體發熱的過程。咳嗽是由于氣管、支氣管黏膜或胸膜受炎癥、異物、物理或化學性刺激引起，聲門關閉、呼吸肌收縮，肺內壓升高，然后聲門張開，肺內空氣噴射而出[21]。實驗研究發現咳嗽與炎癥因子TGF-β1的水平和α-SMA的表達有關[22-23]。桑菊驗證的咳嗽表征的病理機制，是由屬于體內固有免疫的模式識別受體的RIG-I樣受體介導的信號通路RIG-I受體信號通路，通過一系列的信號傳遞，最終激活核因子NF-kB及所介導的通路所致[24-26]。

銀翹散證和白虎湯證的共有通路MAPK信號通路在炎癥反應中發揮重要作用，原癌基因c-JUN的末端激酶（JNK）是MAPK信號通路的另一亞類，一些促炎性因子如TNF-α、白細胞介素家族（IL1、IL6等）都可以激活JNK通路從而加劇炎癥反應[27]。且通過激活白細胞介素受體，啟動MAPK途徑，增加TNF-α、IL-6、IL-8等炎性因子的表達，發生局部炎性反應，引起發熱[28]。故銀翹散證和白虎湯證相較桑菊飲證不具備的信號通路的誘導下熱勢更重。且白虎湯證獨有通路中鈣離子通路又發揮了獨特的作用。細胞中突觸特異性建立的基礎則是鈣信號轉導對單個神經元結構與功能適應的指導[29]。鈣離子在細胞內的分布具有明顯的區域特征，實驗研究發現血清和腦脊液中發熱介質Na+/Ca2+比值的變化與發熱有關，當中樞內固有Na+/Ca2+比值發生改變，即Ca2+外流時比值升高，則體溫升高[30]。且Ca2+是多種細胞功能的普遍調節因子，鈣離子通路的激活誘導Ca2+的釋放，胞漿Ca2+的增加通過鈣離子結合引起的肌鈣蛋白-肌球蛋白復合體的構象變化引起收縮[31]，進而促進胃腸道平滑肌收縮使產熱增加。Ca2+也是心肌細胞中興奮-收縮耦合的核心元素[32]，增強心肌收縮、心臟作功增加。Ca2+作用于骨骼肌、胃腸道平滑肌、心肌等細胞引起產熱增加時，交感神經興奮可以增強Ca2+濃度[33]，是否可以做出Ca2+濃度的增強也可以引起交感神經的興奮、進而促進汗腺分泌功能加強引起大汗出的假設。

綜上，本研究根據“辛凉三劑”方證在風熱病邪侵襲人體后由外及內并在人體內順傳的不同病期的病變機制。風熱犯肺證（桑菊飲證）的咳嗽與與炎癥因子TGF-β1的水平和α-SMA的表達有關。風熱襲衛證（銀翹散證）的發熱則在共有通路基礎上由MAPK信號通路加劇炎癥反應至發熱較前者甚。肺胃熱盛證（白虎湯證）的熱盛、汗出傷津則與鈣離子通路與多重直接聯系。目前，將生物信息學分析應用于中醫藥研究的技術已日臻成熟，下一步擬基于該結果開展動物實驗，以大鼠溫熱模型為研究對象，發揮桑菊飲證、銀翹散證、白虎湯證的生物學作用，進而研究三方證對呼吸系統和消化系統的影響，以期為系統生物學結果的科學準確性提供實驗數據。