肉蓯蓉防治宮腔粘連的作用機制研究*

李敏艷，劉文娥，安建平，楊琴

1 湖南中醫藥大學研究生院 湖南長沙 410007

2 湖南中醫藥大學第一附屬醫院 湖南長沙 410007

宮腔粘連（intrauterine adhesion，IUA）是婦科常見疾病，由宮腔機械操作、炎性反應等多種原因引起子宮內膜基底層損傷，使子宮內膜發生粘連或纖維化，導致宮腔部分或完全封閉的病理癥狀。臨床常表現為月經量減少、閉經、盆腔疼痛及不孕等癥狀，嚴重影響育齡期女性生殖及身心健康。

肉蓯蓉其性味甘、咸，溫；歸腎、大腸經，具有補腎陽、益精血、潤腸通便的功效[1-2]。有研究表明[3]肉蓯蓉具有類性激素樣的效應，能調整腎-天癸-沖任-胞宮軸，改善機體盆腔內環境，促進子宮內膜間質和腺體的修復和增殖。因此，本論文應用網絡藥理學研究方法探索“補腎”類中藥肉蓯蓉對IUA的作用機制，為臨床上IUA藥物的使用及早期干預提供理論依據，在臨床上具有重要的意義。

資料與方法

1 肉蓯蓉活性成分與基因靶點的獲取

在TCMSP數據庫中，將藥物篩選閾值設定為口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，檢索肉蓯蓉的活性成分及對應的靶蛋白。利用Uniprot數據庫和Perl語言，將靶蛋白轉化為對應基因名。

2 IUA靶點基因收集

在GeneCards、OMIM、PharmGkb這三個數據庫中，以“intrauterine adhesion”為檢索詞，分別檢索出IUA疾病靶基因，取并集獲得IUA的疾病靶基因集。

3 肉蓯蓉防治IUA潛在靶點的獲取

利用R語言軟件將肉蓯蓉藥物靶基因與IUA疾病靶基因取交集，獲得肉蓯蓉防治IUA的潛在靶點，并構建Venn圖。

4 肉蓯蓉防治IUA的“藥物-活性成分-潛在靶點”網絡構建

將肉蓯蓉活性成分與潛在靶點相匹配，采用Cytoscape3.8.0軟件構建“藥物-活性成分-潛在靶點”網絡圖。利用插件Network Analyzer進行拓撲學分析篩選出肉蓯蓉防治IUA的關鍵活性成分。

5 肉蓯蓉防治IUA互相作用蛋白網絡圖（PPI）構建

將獲得的潛在靶點導入String數據庫，構建PPI網絡。利用CytoNCA插件進行參數設置，挖掘該調控網絡中的關鍵靶點。

6 GO和KEGG富集分析

運用R語言調用Bioconductor數據包對潛在靶點進行GO分析和KEGG通路富集分析，對分析結果進行可視化，構建“通路-潛在靶點”網絡圖。

7 分子對接驗證

將篩選出的核心靶點和關鍵有效成分進行分子對接驗證。在Pubchem和PDB數據庫中分別獲取對接小分子和靶基因的大分子蛋白構像。運用AutoDock1.5.6軟件進行分子對接，計算對接自由能，篩選出最佳、最合理的對接方式進行分析驗證。

結 果

1 肉蓯蓉的主要活性成分作用靶點

在TCMSP數據庫中共得到肉蓯蓉活性成分5個，分別為β-谷甾醇（beta-sitosterol）、花生四烯酸（arachidonate）、全草含蘇齊內酯（suchilactone）、木脂素（Yangambin）、槲皮素（quercetin），其對應靶蛋白共221個，在Uniprot數據庫中將靶蛋白轉化為對應的基因名，去重后獲得靶基因154個。

2 疾病靶標的篩選

在Genecards、OMIM、PharmGkb數據庫分別篩選出疾病靶點3279個、95個、971個，取并集共獲取肉蓯蓉防治IUA的疾病靶點3880個，與肉蓯蓉藥物靶點取交集，得到藥物-疾病潛在靶點117個，構建Venn圖（見圖1）。

圖1 肉蓯蓉防治宮腔粘連交集基因Venn圖

3 構建藥物-活性成分-潛在靶點網絡

運用 Cytoscape 3.8.0軟件構建“藥物-活性成分-潛在靶點”網絡圖，共有節點123個，150邊條，有效成分按對應的潛在靶點數值大小（degree值）進行排序，分別為槲皮素113個、β-谷甾醇21個，全草含蘇齊內酯7個，木脂素5個，花生四烯酸4個（見圖2）。由此可知肉蓯蓉在治療IUA時槲皮素和β-谷甾醇可作用于多靶點發揮主要作用，而其他活性成分參與并不多，說明槲皮素和β-谷甾醇可能是肉蓯蓉治療IUA的關鍵活性成分。

圖2 肉蓯蓉防治IUA“藥物-成分-潛在靶點”網絡圖

4 PPI網絡圖構建

在STRING數據庫對117個潛在靶點進行相互作用分析，設置combined score>0.9，輸出目標文件，導入Cytoscape3.8.0軟件中繪制PPI網絡圖，共得到99個節點和340條邊的（見圖3A），運用CytoNCA插件設置參數進行兩次篩選，獲得肉蓯蓉治療IUA的核心靶點基因為JUN、MAPK1、AKT1、TP53、RB1、TNF、CCND1、RELA、MYC等9個（見圖3B、3C）。

圖3 肉蓯蓉防治IUA共同靶點PPI網絡圖

5 GO和KEGG分析

通過GO功能富集分析，肉蓯蓉與IUA相關的潛在關鍵靶點基因涉及生物過程（Biological Process，BP）富集條目2086條，主要包括細胞對化學應激的反應、脂多糖的反應、活性氧代謝過程等；細胞組成（cellular component，CC）52條，主要包括膜筏、膜微域、膜區等；分子功能（molecular function，MF）148條，主要包括DNA聚合酶轉錄因子結合、RNA聚合酶Ⅱ-特異性DNA-結合轉錄因子結合、泛素樣蛋白連接酶結合等（見圖4）。

圖4 肉蓯蓉防治IUA潛在靶點GO氣泡圖

KEGG富集分析結果顯示共154條通路，其主要涉及代謝、腫瘤、病毒感染、炎性反應等多種信號通路（見圖5）。以通路富集的基因數目對排序前20的通路及對應的基因導入Cytoscape3.8.0中構建“潛在靶點-通路”網絡并進行可視化（見圖6A）。根據Degree值取排名前10的靶蛋白制作柱狀圖（見圖6B），依次為 AKT1、MAPK1、TP53、RELA、CCND1、CDKN1A、RAF1、CASP3、TNF、BAX。

圖5 肉蓯蓉防治IUA潛在靶點KEGG氣泡圖

圖6 肉蓯蓉預防IUA“潛在靶點-通路”網絡圖

6 分子對接驗證結果

將PPI網絡和KEGG富集分析獲得關鍵靶點取交集獲得核心靶點為AKT1、MAPK1、TP53、TNF、RELA、CCND1。并與肉蓯蓉的活性成分逐一進行分子對接。將對接結果繪制成熱圖（見圖7A）。根據配體和受體結合能越低，結合越穩定的原理，可以看出槲皮素、β-谷甾醇與關鍵靶點結合效果較佳，其中槲皮素與RELA對接效果最佳，能量為-9.7kcal/mol，分子對接情況如圖所示（見圖BCD）。

圖7 A圖為肉蓯蓉主要活性成分與核心靶基因對接能量值熱圖；B圖為槲皮素與RELA對接分子結構圖；C圖為β-谷甾醇與AKT1對接分子結構圖；D圖為全草含蘇齊內酯與RELA對接分子結構圖。

討 論

IUA在中醫傳統醫學中屬于“月經量少”“閉經”“不孕”等范疇。IUA多由金刃損傷所致，金創之法對胞宮造成損傷，導致胞脈、沖任、氣血受損，耗傷腎之元氣精血，而腎為先天之本，主生殖，為天癸之源，沖任之本，氣血之根，故多出現經少、閉經，不孕等情況。后代醫家認為宮腔粘連的病機為腎虛血瘀，腎虛為本，血瘀為標，屬本虛標實，故治療當以補腎為主。

本研究檢索出肉蓯蓉的五種有效成分，推斷出槲皮素、β-谷甾醇為肉蓯蓉防治IUA的關鍵有效成分。分子對接結果也證實槲皮素、β-谷甾醇對接結果較其他活性成分更佳，推測出槲皮素、β-谷甾醇是肉蓯蓉防治IUA發揮作用的主要成分。通過GO分析，推斷肉蓯蓉防治IUA的作用機制是通過有效成分和某些DNA/RNA聚合酶轉錄因子、泛素樣蛋白連接酶等結合調節活性氧代謝、參與細菌來源分子反應、炎癥反應、氧化應激等生物過程實現的。現代藥理學表明，槲皮素、β-谷甾醇具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌、抗纖維化等生物活性[4-5]。槲皮素具有清除氧自由基及超氧陰離子，并通過提高超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛含量，可以減輕組織的氧化應激損傷和病理性修復[6-8]。槲皮素還可調控TLR4/NF-kB通路，調節NO釋放，降低TNF-α、IL-1β等炎癥因子的分泌，減輕炎癥反應，并抑制細胞的凋亡[9-10]。研究發現β-谷甾醇也可調控NF-kB/MAPK信號通路減少細胞中炎性因子生成，發揮抗炎，抗氧化作用，減輕細胞的損傷[11-12]。此外，β-谷甾醇可減少細胞外基質CollagenⅠ的沉積，促進α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達，抑制組織、器官纖維化病理過程[13]。

肉蓯蓉防治IUA篩選出核心靶點為AKT1、CCND1、MAPK1、RELA、TNF、TP53，預測肉蓯蓉防治IUA主要通過調節這些基因靶點發揮作用。目前大量實驗研究[14-15]發現抑制TNF、IL炎癥因子和TGF-β1、MAPK1、AKT蛋白的分泌，可減輕IUA的粘連程度，其機制主要與減輕子宮內膜修復過程中炎癥反應及纖維化的發生，促進子宮內膜的修復與再生。RELA是NF-kB信號通路中的重要轉錄因子，可調控 TNF-α、IL-17等多種炎性介質的表達來介導炎癥反應，參與細胞免疫及凋亡等生物過程[16]。宮腔內的腫瘤也是引起IUA重要原因之一，TP53、CCND1主要調節細胞增殖分化，從而影響IUA的發生發展。

KEGG分析結果顯示，其富集通路主要涉及炎癥反應、病毒感染、惡性腫瘤及內分泌紊亂等方面，主要包括AGEs-RAGE、HIF、TNF、IL等通路及通路調控因子。AGEs-RAGE信號通路是抗纖維化的主要通路之一，糖化終產物（AGEs）可以刺激單核巨噬細胞分泌TNF-α、IL-1等因子來促進細胞基質中層連蛋白（Laminin）的表達，誘導間皮細胞合成基質增加，導致大量基質蛋白堆積或基質成分被AGEs修飾而發生結構改變，最終誘發纖維化病理改變[17]。此外，AGEs-RAGE通路還可以調控上皮細胞內氧化酶系統，促進炎癥因子的表達，導致細胞炎癥損傷與凋亡[18]。HIF在IUA患者子宮內膜中表達，并與IUA的粘連纖維化成正相關，HIF可調控缺氧調節機制，缺氧時HIF-1α誘導p53上調抑制細胞周期進程，導致G2/M細胞的積聚，并激活TGF-β、CTGF等因子，促進纖維化的發生[19]。TNF-α、IL作為纖維化因子、炎癥介質和免疫調節因子，與IUA的發生發展密切相關，促進炎癥反應，刺激血管收縮，使子宮內膜缺血缺氧情況加重，促進IUA的形成[20]。

綜上，本研究通過網絡藥理學預測肉蓯蓉防治IUA的分子機制研究得出槲皮素、β-谷甾醇是肉蓯蓉預防IUA關鍵有效成分，主要通過作用AKT1、MAPK1、RELA、TNF等基因靶點來調節AGE-RAGE、HIF、TNF等多條信號通路發揮作用，其作用生物機制與調控纖維化、炎癥反應、氧化應激反應、細菌病毒感染等密切相關。這些機制有部分在當前已有的文獻中得到證實，但仍有部分機制可能需要后續實驗研究加以證明。因此，對肉蓯蓉防治IUA的分子機制的研究有一定參考價值，可為后續實驗設置提供思路。