蒺藜治療高血壓病作用機制分析*

王哲，耿乃志

1 黑龍江中醫(yī)藥大學 黑龍江哈爾濱 150040

2 黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院 黑龍江哈爾濱 150040

高血壓病（Hypertension）是指以體循環(huán)動脈血壓（收縮壓和/或舒張壓）增高為主要特征（收縮壓≥140 mmHg，舒張壓≥90 mmHg），可伴有心、腦、腎等器官的功能或器質性損害的臨床綜合征。[1]根據(jù)血壓升高的水平，將高血壓分為1級、2級、3級；根據(jù)有無其他危險因素，將高血壓分為低危、中危、高危、很高危；根據(jù)發(fā)病原因的不同，可分為原發(fā)性高血壓和繼發(fā)性高血壓。高血壓病因復雜，包括遺傳、年齡、飲食、生活等諸多方面，其中高鹽、高脂引起得肥胖為主要高危因素。[2]作為一種常見的慢性心血管疾病，高血壓患病率在我國人群中呈逐年升高趨勢，但知曉率、治療率和控制率較低。[3]

高血壓病屬中醫(yī)“眩暈”“頭痛”范疇，有虛實之分。[4]《黃帝內經(jīng)》認為高血壓病機為“諸風掉眩，皆屬于肝”，得到歷代醫(yī)家的廣泛認可，但隨著現(xiàn)代醫(yī)學治療手段的不斷完善，高血壓病的病程發(fā)展得到很大程度延緩，其病機也隨之改變。現(xiàn)醫(yī)家普遍認為高血壓多因風、火、痰等病理因素影響肝、脾、腎三臟引起情志不遂、勞逸失度、年老體虛、飲食不節(jié)而發(fā)病。[5]現(xiàn)代醫(yī)學主要通過改善生活方式、糾正可干預的危險因素與藥物治療相結合的方法，以降低高血壓的靶器官損害與血管并發(fā)癥的發(fā)生和死亡風險。中藥是傳統(tǒng)醫(yī)學的重要組成部分，成分復雜，具有多成分、多通路、多靶點等特點，在治療時傳統(tǒng)醫(yī)學更能與高血壓相適應。與現(xiàn)代醫(yī)學不同，傳統(tǒng)醫(yī)學更注重“未病先防”，因此中藥治療高血壓前期常療效顯著，治療過程中不會引起直立性低血壓、糖耐量降低、血膽固醇升高及電解質紊亂等不良反應。[6]

蒺藜為臨床治療高血壓的常用藥物之一，首載于《神農本草經(jīng)》，是蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestris L.的干燥成熟果實，有平肝解郁、活血祛風、明目、止癢之功效，可治療頭痛眩暈、胸脅脹痛、乳閉乳癰、目赤翳障、風疹瘙癢等癥。此外，現(xiàn)代藥理研究證明，蒺藜具有降壓降脂、抗動脈硬化、延緩心室重構、改善心功能等作用，故常用于高血壓及其并發(fā)癥的治療。[7-10]蒺藜治療高血壓的潛在關聯(lián)與作用機制尚不明確，本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法從蒺藜有效活性成分、作用靶點、信號通路等方面對其論證。

材料與方法

1 蒺藜活性成分篩選

基于中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）分別以生物利用度（OB）、類藥性（DL）為標準采集蒺藜的活性成分和作用靶點。

2 蒺藜活性成分作用靶點和高血壓相關靶點獲取

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫提取蒺藜全成分對應的作用靶點信息，基于“1.1”方法篩選的蒺藜有效活性成分提取蒺藜有效成分相關靶點的集合，將靶點信息導入蛋白質序列數(shù)據(jù)庫（Universal Protein，UniPort）獲得標準化基因名稱，即為蒺藜活性成分的作用基因名稱。

利用人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards：The Human Gene Database）、人類孟德爾遺傳病數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）中 以“Hypertension”為關鍵詞檢索與高血壓相關的基因靶點、基因圖譜。

利用R4.0.3軟件將藥物靶點與疾病靶點相互映射并繪制Venn圖，得到蒺藜治療高血壓的相關信息。

3 構建可視化調控網(wǎng)絡

將基于方法“1.2”得到的蒺藜活性成分、作用靶點和高血壓靶點整合，導入Cyroscape3.8.1軟件中進行網(wǎng)絡可視化，獲得蒺藜-靶點-效應通路的網(wǎng)絡模型。

4 構建蒺藜-高血壓蛋白互作網(wǎng)絡構建

使用STRING數(shù)據(jù)庫平臺，導入蒺藜-高血壓交集靶點，構建藥物與疾病的蛋白質相互作用網(wǎng)絡并制作其蛋白互作網(wǎng)絡圖（protein-to-protein interaction，PPI）。

5 GO生物功能富集分析和KEGG通路注釋分析

利用R4.0.3軟件對“1.4”方法得到的蒺藜活性成分靶點和高血壓靶點交集基因進行GO生物功能富集分析和KEGG通路注釋分析，以說明蒺藜干預高血壓的靶點在基因功能和信號通路的富集情況。

結 果

1 蒺藜活性成分收集

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫得到關于蒺藜的有效成分共計51種，以生物利用度（OB≥30%）、類藥性（DL≥0.18%）為依據(jù)進行過濾后，最終獲得12種生物有效活性成分。見表1。

表1 蒺藜有效活性成分基本信息

2 蒺藜活性成分作用靶點和高血壓相關靶點獲取

借助TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出蒺藜有效活性成分相關蛋白靶點共364個，經(jīng)UniPort數(shù)據(jù)庫校正后得到43個藥物活性成分相關基因靶點。以“Hypertension”為關鍵詞搜索GeneCards數(shù)據(jù)庫得到8435個靶點，OMIM數(shù)據(jù)庫得到56個靶點，將兩者整理合并去除重復后共獲得8429個靶點，其中有39個靶點與蒺藜的有效活性成分靶點相同。見表2，圖1。

表2 蒺藜-高血壓潛在靶標基本信息

圖1 蒺藜治療高血壓靶點預測Venn圖

3 構建蒺藜治療高血壓的調控網(wǎng)絡

通過Cyroscape3.8.1軟件構建蒺藜與高血壓的調控網(wǎng)絡，其節(jié)點為本研究篩選出蒺藜及有效活性成分、高血壓及其相關靶點。利用Cyroscape3.8.1軟件的Network Analyzer插件分析可知蒺藜中山柰酚（kaempferol）、異鼠李素（isorhamnetin）的網(wǎng)絡度值最高，分別為32和16，說明蒺藜干預高血壓的過程中山柰酚、異鼠李素可能占據(jù)重要作用。見圖2。

圖2 蒺藜-靶點-效應通路的網(wǎng)絡模型

4 構建蛋白互作網(wǎng)絡

使用STRING數(shù)據(jù)庫平臺構建PPI網(wǎng)絡，以人為限定物種、閾值≥0.4為篩選條件，隱藏游離基因后，得到39個節(jié)點，168條邊的PPI網(wǎng)絡（圖3）及tsv文件，并借助R4.0.3軟件分析后得知相關性前5位核心基因分別為MAPK8、AHR、AR、CASP3、ESR1。

圖3 蒺藜治療高血壓的蛋白互作網(wǎng)絡圖

5 GO生物功能富集分析

借助R4.0.3軟件對核心靶點進行GO生物功能富集分析，共得到81個相關條目（P<0.05）。根據(jù)分析結果可知，核心靶點在核受體活性（nuclear receptor activity）、配體激活的轉錄因子活性（ligand-activated transcription factor activity）、類固醇結合（steroid binding）、類固醇激素受體活性（steroid hormone receptor activity）、轉錄共激活因子結合（transcription coactivator binding）等方面富集程度較為集中。見圖4。

圖4 蒺藜治療高血壓核心靶點的GO生物功能富集分析

6 KEGG通路注釋分析

借助R4.0.3軟件對核心靶點進行KEGG通路注釋分析，共得到73個信號通路（P<0.05）。根據(jù)分析結果可知蒺藜主要通過流體剪切應力與動脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、TNF信號通路（TNF signaling pathway）、細胞色素P450對外源物質的代謝作用（Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450）、化學致癌作用（Chemical carcinogenesis）等信號通路干預治療高血壓。見圖5、圖6。

圖5 蒺藜治療高血壓核心靶點的KEGG信號通路富集分析柱狀圖

圖6 蒺藜治療高血壓核心靶點的KEGG信號通路富集分析氣泡圖

討 論

高血壓是一種多因素、多環(huán)節(jié)、多階段的疾病，常因遺傳與環(huán)境因素相互作用而誘發(fā)，與心血管疾病和全因死亡率的風險相關[11]。本研究借助網(wǎng)絡藥理學方法探究蒺藜干預高血壓的潛在關聯(lián)與作用機制。

通過對蒺藜活性成分與蛋白靶點的搜索和篩選，得到12種有效活性成分，43個蛋白基因靶點，其中山柰酚和異鼠李素為蒺藜的核心成分；針對高血壓基因靶點的搜索匯總和去除重復，獲得與高血壓相關的8429個相關靶點，其中蒺藜蛋白靶點與高血壓基因靶點交集基因39個；蒺藜主要靶點多富集于核受體活性、配體激活的轉錄因子活性、類固醇結合、類固醇激素受體活性、轉錄共激活因子結合等生物功能，通過流體剪切應力與動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、細胞色素P450對外源物質的代謝作用、化學致癌作用等信號通路，作用于MAPK8、AHR、AR、CASP3、ESR1等核心靶點，對高血壓起干預治療作用。

山柰酚和異鼠李素可抑制CYP1B1表達并拮抗AHR活化。[12]多項研究表明，調節(jié)CYP1B1可預防肥胖、高血壓、動脈粥樣硬化和癌癥。[13]山柰酚具有抗炎、抗氧化、抗凋亡作用[14]，可通過抑制血清中IL-6、TNF-α等炎性因子的水平，抑制MAPK的表達。[15-16]異鼠李素通過抗炎、抗氧化、調節(jié)細胞凋亡等機制而具有器官保護、預防肥胖、免疫調節(jié)、保護心腦血管等作用[17]。異鼠李素抑制NF-κB信號通路過度激活，減輕炎癥和氧化應激反應[18]。MAPK8調控自噬激活相關信號通路[19]；AHR在屏障組織或在代謝中起重要作用[20]；AR主要介導雄激素的相互作用[21]；CASP3基因主要編碼細胞凋亡的執(zhí)行階段的關鍵蛋白酶[22]；ESR1可介導雌激素的作用[23]。以上調節(jié)因子廣泛參與炎癥、機體代謝和細胞凋亡等生理過程。流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路作用于內皮剪切應力誘導阻力動脈的血管舒張，并在動脈粥樣硬化傾向中起主要作用[24]。AGE / RAGE信號可通過激活Nox-1和降低SOD-1的表達來增加氧化應激，從而促進糖尿病介導的血管鈣化[25]。TNF即腫瘤壞死因子，是細胞凋亡以及炎癥和免疫的主要介體，可誘導細胞膜上多蛋白信號復合物的形成[26]。細胞色素P450酶在異生物素的排毒，細胞代謝和體內平衡中起關鍵作用[27]。 化學致癌涉及控制細胞增殖、細胞死亡和DNA修復的基因突變-即原癌基因和抑癌基因中的突變[28]。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法探究蒺藜治療高血壓的潛在作用機制。研究結果表明，蒺藜中活性成分可能通過抗炎、抗氧化、抗凋亡等機制對高血壓的治療起主要藥理作用，為后續(xù)科學研究及臨床應用提供一定的基礎，為中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展提供幫助。