甘草養陰湯對老年類風濕關節炎的價值探索*

陳永，陳艷娟，劉冬舟

1 暨南大學第二臨床醫學院（深圳市人民醫院） 廣州廣東 518000

2 暨南大學基礎醫學院 廣州廣東 510632

類風濕關節炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種以關節滑膜炎癥為病理機制的自身免疫病，其突出病理特點是滑膜增生并侵蝕關節軟骨和骨質，最終導致關節破壞畸形[1]。在發達國家RA患病率為0.5%～1%，中國大陸地區發病率為0.42%。每年新發病RA人數為每5～50人/10萬人[2]。在RA患者人群中有一組特殊的人群，即老年RA患者。老年的RA患者包括60歲以后發病的患者和年輕時候發病但是超過60歲的老年人群[3]。由于人口的老齡化以及老年發病率增加，老年的RA患病人群在逐年升高[4]。相對于年輕發病的RA患者，老年發病的RA患者具有發病急、常伴系統損害、功能預后差等特點[5]。另外由于合并癥增多，老年RA患者常需要多種藥物治療各種合并癥，這使得復雜的RA治療方案難以優化，并且由于肝和腎功能不全而增加藥物相互作用、不良事件和禁忌癥的可能性[6]。因此常規的RA達標治療對于老年患者藥物副作用風險面臨挑戰。臨床對老年RA的治療常常未能達標[7-8]。

中醫藥控制RA的相關研究也非常豐富。但是在臨床實踐中，單純以中藥控制RA常難以達到讓患者滿意的效果。但中醫藥是基于整體觀，在對患者整個機體康復中凸顯特色[9-10]，尤其是在與西藥聯用時，起到減毒增效的作用。顯然中藥在中西醫結合治療老年性RA患者有一定的優勢。前期在研究白塞病的治療方劑中，發現出自《傷寒雜病論》的甘草瀉心湯可用于消化系統、神經系統、免疫系統、內分泌系統、婦科等疾病[11-12]。體現異病同治的效應。在臨床實踐中，為了降低毒性、使藥性更加溫和，作者結合中醫藥理論知識及國內外文獻研究結果，對甘草瀉心湯進行了改良，使其更適合老年性RA，并將改良后的藥方命名為甘草養陰湯（Gancao Nurish-Yin decoction，GCNY）。改良后的配方成分包括：甘草、人參、干姜、蒲公英、羅漢果、玉竹、大棗等7種中藥成分（專利申請號：201910843519.9）通過研究顯示對RA有效。本研究擬運用網絡藥理學挖掘GCNY作用于老年RA的靶點并研究其作用的信號通路，為進一步實驗研究提供一定的理論依據。

研究方法

1 藥物有效成分及作用靶點獲取

使用中藥系統藥理學數據庫及分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）[13]中檢索窗口依次輸入中藥名稱：甘草、人參、大棗、玉竹、羅漢果、干姜，搜索的得到對應的有效化學成分（Mol ID），設置篩選條件：口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥物特性（Drug-like properties，DL）≥0.18。然后在該平臺檢索各種化學成分作用的靶點蛋白。利用疾病靶點標準化Uniprot數據庫[14]，分別檢索上述得到藥物潛在靶點蛋白名稱，種屬設置為“Homo sapiens”，獲取其靶點的標準基因名。其中，TCMSP數據庫未檢索到蒲公英的有效作用成分，遂通過中藥綜合資源數據庫（The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM）[15]共查得蒲公英的基因靶點25個。

2 GCNY藥物-成分-靶點網絡的構建

將GCNY7種中藥對應的有效成分與作用靶點基因導入Cytoscape 3.7.1 軟件中，利用軟件功能構建藥物-成分-靶點網絡作用圖，在網絡圖中單味中藥種類、有效活性成分和靶點基因用不同形狀或者顏色的節點表示。

3 疾病相關基因的篩選

在GeneCards數據庫中檢索與“衰老（Aging）”及“類風濕關節炎（rheumatoid arthritis）”相關的靶點基因，分別獲得26060個、4465個，將這些疾病靶點基因輸入計算機R語言中，剔除重復基因名稱，選擇相關相關系數（“Relevance.score”）大于10的相關基因，最終獲得216個衰老相關的基因和393個RA相關基因。

4 GCNY作用于衰老的靶點及信號通路分析

為了進一步探究GCNY與衰老及RA的相互作用關系，在計算機R語言中使VennDiagram包將GCNY靶點基因和衰老或RA相關基因作交集，即獲得衰老與RA或者三者的共同靶點基因，并繪制韋恩圖。并對獲得的交集基因使用R軟件中ClusterProfile包中的enrichGO函數對差異基因進行GO功能富集分析和enrich KEGG函數進行信號通路富集分析[17]。

5 蛋白相互作用（PPI）網絡的構建

將上述的得到GCNY作用于衰老和RA的交集基因上傳至STRING數據平臺[18]，選擇“multiple proteins”模式，蛋白種屬設為“Home sapiens”，建立藥物靶蛋白-疾病靶蛋白（PPI）相互作用網絡，網絡圖構建采用默認參數，下載PPI網絡圖的數據矩陣，并將其輸入Cytoscape 3.7.1 軟件，繪制GCNY作用于衰老和RA交集靶點的蛋白互作網絡圖。

結 果

1 GCNY的作用靶點挖掘

GCNY除蒲公英以外共含有有效成分130個，包括蒲公英整個配方成分共涉及靶點277個。將基因靶點上傳至 Cytoscape 3.7.1 軟件構建藥物-成分-靶點網絡圖（圖1）。其中，甘草有效作用成分包括Inermine、Mairin、甘草酚、Jaranol、苜蓿素等88個；作用靶點基因20個，如PIK3、PGR、KDR、NOS2、HTR2A等。大棗有效成分28個如千金藤堿、香豆素、豆甾醇等；作用靶點基因202個，如DRD1、HSP90、CYP3A4、AR、PDE10A等。人參有效作用成分17個，如β-谷甾醇、山奈酚、人參皂苷rh2等；作用基因靶 點231個；如：TNF、IL1B、F10、GSTM1、PRKACA等。羅漢果有效作用成分6個，如鄰苯二甲酸2-乙基己酯、黑麥草堿等；作用靶點基因23個，如PTGS1、RXRA等。干姜有效作用成分5個，包括3，4，5，7-四羥基-8-甲氧基黃酮、谷甾醇等；作用基因靶點22個，CDK2等。玉竹有效作用成分6個，如4’，5，7-三羥基-6-甲基-8-甲氧基-高異黃酮、正香豆酰酪胺等；作用靶點基因20個，MAOB、CALM、NOS2等。在TCMSP中未檢索到蒲公英有效成分，通過TCMIP數據庫，查得蒲公英作用靶點基因25個，包括LSS、VDR、ESR1等。多種成分共可共同調節一些相同的靶點基因。如配方的7種成分均可作用于PGR、NCOA2；除蒲公英外，其余6種成分均可作用于PTGS1、SCN5A、PTGS2、HSP90AA1、PRKACA、NOS2、NR3C2、PDE3A、AR等靶點，見圖1。

圖1 GCNY藥物-成分-靶點相互作用網絡圖

2 RA與衰老共同基因靶點

通過數據庫共獲得到RA發病相關基因393個、衰老相關基因216個、RA合并衰老共同基因61個，包 括TP53、IGF1、MMP1、MMP9、PTGS2、NOS2、STAT3等（圖2）。主要參與的信號通路包括：糖尿病并發癥中的年齡-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、類 風 濕關節炎（rheumatoid arthritis）、癌癥中的蛋白多糖（proteoglycans in cancer）、脂質和動脈硬化（lipid and atherosclerosis）、IL-17信號通路等通路，見圖2，圖3。

圖2 RA與衰老的共同基因靶點及KEGG富集相關通路

圖3 RA與衰老的共同基因靶點參與的前20個信號通路

3 GCNY作用與老年RA的基因靶點分析

在RA與衰老的共同參與基因中，可被GCNY作用的基因靶點共26個，包括：VEGFA、MMP9、CCL2、TNF、ALB、IL6、IL1B、MMP2、TP53、IL10、TGFB1、STAT3、CXCL8、PTGS2、NOS2、ESR1、MMP1、ICAM1、IFNG、MAPK1、IL2、COL1A1、IL1A、MPO、CRP、CAT等（圖4A，B）。

圖4 GCNY潛在作用于RA合并衰老的共同基因靶點

GCNY潛在作用于RA、衰老及RA合并衰老的共同基因靶點；（B）GCNY潛在作用于RA合并衰老的共同基因靶點的蛋白相互作用PPI網絡圖。

通過GO富集通路分析，GCNY潛在作用于RA合并衰老的共同基因靶點作用于生物學過程的通路包括對氧化應激的反應（response to oxidative stress）、對 細 菌 來 源 的 分 子 的 反 應（resopnse to molecule of bacterial origin）、對 脂 多 糖 的 反 應（response to lipopolysaccharide）、活性氧代謝過程的調 節（regulation of reactive oxygen species metabolic process）；作用于細胞成分的載體腔（veicle lumen）、分泌顆粒腔（secretory granule lumen）、血小板α顆粒腔（platelet alpha granule lumen）；分子功能方面包括：四吡咯結合（tetrapyrrole binding）、受體配體活性（receptor ligand activity）、過氧化物酶活性（peroxidase activity），見圖5。

圖5 GCNY潛在作用于RA合并衰老的共同基因靶點的GO通路富集分析

討 論

RA是最常見的全身性和慢性自身免疫性疾?。╝utoimmune diseases，AID）之一。 除了骨和關節軟骨是最易受損害外，其他器官也可能受累并導致多種表現，如貧血、骨質疏松、感染、皮膚或肺損傷[19]。隨著慢性炎癥被證明是導致衰老和年齡相關疾病發病的機制之一，炎癥相關性衰老引起重視[20]。來自臨床觀察的證據表明患有AID的患者，如RA、系統性紅斑狼瘡 、強直性脊柱病、白塞氏病都表現出對老年相關疾?。╝ge-related disease，ARDs） 的易感性，尤其是心血管疾病 、糖尿病等[21-22]。對于這一現象的解釋是炎癥性衰老（inflammation），即炎癥及炎癥影響了代謝相關生物學過程，進而調控衰老進展[23]。在本研究中，TP53、IGF1、MMP1、MMP9、PTGS2、NOS2、STAT3等61個基因靶點參與RA發病的基因，也被發現是同時參與衰老的相關基因。

在抑制炎癥方面，GCNY配方相關的7種植物成分及其單體成分研究比較豐富。如研究顯示：甘草查耳酮（Licochalcone A、B、和D）顯著抑制LPS誘導的NF-κB轉錄激活，Licochalcone B和D顯著降低LPS誘導的NO，TNF-α和MCP-1的產生[24]；從甘草根中提取的一種天然黃酮類脂蛋白Liquiritin，能顯著抑制IL-1β誘導的RA-FLS的增殖、促進核DNA片段化、并改變線粒體膜電位以加速細胞凋亡、Liquiritin通過下調Bcl-2/Bax的比例，并抑制VEGF的表達以及JNK和P38的磷酸化，顯示改善了RA炎癥浸潤和血管生成的臨床評分、并在體內誘導了滑膜組織的細胞凋亡[25]。大量研究證明了人參和人參皂甙的抗炎特性，它們對RA發病機理的改善作用。如化合物K（compound K，CK）通過抑制Janus激酶（JAK）和細胞外信號調節激酶（ERK）信號傳導途徑，顯著降低了RA成纖維樣滑膜細胞MMP-1和MMP-3的產生；人參皂甙Rb1（G-Rb1）顯著抑制了干擾素-γ誘導的人RA患者外周血單個核細胞、軟骨細胞和成纖維樣滑膜細胞中TNF-α的表達[26]。從中草藥蒲公英中分離出來的一種生物活性五環三萜類化合物之一的蒲公英醇（taraxasterol，TAR）顯著抑制CIA小鼠中IL-1β誘導的促炎性細胞因子表達，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6和IL-8、以及基質金屬蛋白酶（MMP）的產生[27]。同樣，在體內和體外實驗中大量研究證實GCNY配伍中的其它植物成分，如羅漢果、玉竹、大棗和干姜所含有的成分同時具有抑制炎癥反應的作用和抗衰老的作用。

通過網絡藥理學數據挖掘，GCNY作用于RA和衰老的共同靶點基因26個，其中細胞因子通路、細胞因子受體、趨化因子受體和抗氧化通路等是重要的靶基因富集通路。當然GCNY的功效和潛在機理是網絡藥理學不能完全詮釋的。如GCNY中，甘草益氣補中，清熱解毒為君藥；人參補氣、生津，玉竹養陰潤燥，協調甘草作用，并消除其水鈉潴留的副作用，為臣藥。蒲公英、羅漢果清熱解毒，干姜溫中散寒，回陽通脈，屬于佐藥；大棗養血安神、緩和藥性為使藥。整個配方陰陽調和、滋陰為主，陰中求陽；對機體的陰陽失調形成了“緩沖液”一樣的作用。而這些是無法通過網絡藥理學進行論證的。中西醫結合治療老年類風濕關節炎是體現中醫優勢、提高患者療效的可靠途徑，我們將進一步通過基礎及臨床研究對GCNY作用機制及療效評價進行研究開發。