“鉤藤-黃芩”藥對治療癲癇的潛在作用機制探討*

周嬌嬌，張青萍，吳成挺，李果，何業輝，吳鵬

1 廣西中醫藥大學 廣西南寧 530200

2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院 廣西南寧 530023

癲癇的發作與腦神經元的異常過度放電有關，是以突發性或暫時性的意識、感覺、運動、自主神經或精神行為異常為主要臨床表現的中樞神經系統疾病[1-2]。流行病學顯示，癲癇的全球患病率為 7.6‰，其中10%～20%的患者停藥后容易復發[3]。目前臨床應用丙戊酸鈉、苯妥英鈉、卡馬西平等西藥抗癲癇治療，這些藥物治療癲癇的臨床療效雖然得到了肯定，但卻存在著共濟失調、眩暈頭痛、過敏等不良反應，部分患者常常因不能耐受而中斷治療[4]。因此迫切需要副作用更小，療效更穩定的新藥來進一步補充。中藥治療癲癇具有療效好、副作用小，整體辨證施治的特點，可在一定程度上彌補西醫治療的不足，得到越來越多學者的認可[5]。

癲癇屬于中醫“癇病”“癇證”“癲疾”的范疇，與風、痰、熱、瘀、毒等病理因素密切相關[6-7]。《內經》有言“諸風掉眩皆屬于肝，熱盛動風，風勝則動”，《醫方考》曰：“癲疾者，風痰之故也……風熱盛于肝，則一身之筋牽掣，故令手足搐溺也”，均表明癇病的發病與肝熱盛、肝陽亢密切相關。因此，臨床上治療癇病中醫辨治注重“清肝瀉火”[8-9]。“鉤藤-黃芩”是導師治療癲癇的常用藥，臨床療效顯著，鉤藤首載于陶弘景《名醫別錄》，其味甘，性凉，“入足厥陰肝經，瀉濕清風，止驚安悸”，既清肝熱，平肝陽，又能息風定驚止痙。黃芩始載于《神農本草經》，其味苦，性寒，主入少陽經 ，善清中上焦濕熱，具有清熱燥濕、瀉火解毒之功。鉤藤、黃芩相使為用，黃芩可增強鉤藤清肝熱平肝陽之功效，大大提高了治療肝火痰熱癲癇的臨床效果。現代藥理研究顯示，鉤藤具有神經保護、鎮靜催眠、抗驚厥癲癇、保護心肌、降壓、抗腫瘤、抗炎、抗氧化等藥理作用[10-11]。黃芩既可抗驚厥、保護神經，亦可抗癲癇[12]，其中黃芩有效成分黃芩苷保護神經元、抗癲癇作用已在試驗觀察中得到證實[13-15]，但目前尚沒有確切的證據表明“鉤藤-黃芩”兩者合用能有效地改善癲癇的癥狀，所以發現治療癲癇的關鍵活性成分及潛在作用機制尤為重要，以更好的應用于臨床上治療癲癇病。

網絡藥理學是以“藥物-有效成分-基因-疾病”為關系網，從系統生物學與生物網絡平衡的角度剖析中藥治療疾病的作用靶點，從而預測出藥物的潛在作用機制的一種新興研究方法[16]。本研究基于網絡藥理學方法來剖析“鉤藤-黃芩”治療癲癇的潛在作用機制，以期于臨床上對癲癇的治療提供相關的參考。

鉤藤和黃芩有效成分篩選

本研究運用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform），分 別以“鉤藤”和“黃芩”為關鍵詞，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物類藥性（drug likeness，DL）≥0.18為篩選條件，檢索其有效活性成分。

1 鉤藤和黃芩作用靶點篩選

通過Uniprot數據庫（https://www.uniprot.org/）查詢其活性成分所對應的靶點基因，將靶點名稱標準化，整理后去除重復值，獲得最終中藥作用靶點。

2 癲癇相關靶點篩選

以“epilepsy”為 檢 索 詞，運 用OMIM 、CTD、DisGeNET等數據庫搜索癲癇疾病靶點，導出結果，整合各個數據庫獲得的疾病靶點，利用Excel去除重復項得到癲癇相關靶點數據。

3 獲取“鉤藤-黃芩”靶點與癲癇靶點的交集

借助Venny2.1在線軟件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），把“鉤藤-黃芩”作用靶點與癲癇靶點取交集，得到“鉤藤-黃芩”治療癲癇的關鍵靶點，即中藥-疾病共同靶點，并繪制韋恩圖（見圖1）。

4 中藥-有效成分-靶基因-疾病調控網絡的構建

運用Cytoscape3.8.2軟件繪制并構建中藥-有效成分-靶基因-疾病調控關系網絡（見圖2），將1.1獲得的“鉤藤-黃芩”有效活性成分和1.4獲得的“鉤藤-黃芩”與癲癇交集靶點進行關聯及拓撲學參數分析。

5 PPI網絡的構建與核心基因的篩選

將藥物-疾病交集靶點導入string11.0在線軟 件（https://string-db.org/），在“Organism”中 選 擇“homo sapiens”，保存string_interactions.tsv文件，運用Cytoscope3.8.2軟件對該文件節點分析排序處理（見圖3）。再運用R軟件中的count.R對該文件進行運算，最終得出PPI網絡核心基因條形圖（見圖4）。

6 中藥-疾病靶點GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

下載clusterProfilerGO.R功能包將1.4中藥-疾病交集靶點進行運算分析，得到GO功能富集分析（見圖5）和KEGG通路富集分析（見圖6），以P≦0.05為差異有統計學意義，取前20的結果。

結 果

1 鉤藤有效成分和靶點預測結果

在TCMSP數據庫中檢索到主要有效成分鉤藤33個，黃芩36個，去除重復項后，共獲得66個目標成分，檢索得到對應的鉤藤相關靶點1074個，黃芩相關靶點1203個，去除重復項后得到鉤藤對應靶點103個，黃芩對應靶點53個，合計“鉤藤-黃芩”作用靶點156個，去除重復項113個。

2 中藥-疾病靶點構建結果

圖1韋恩圖表明中藥-疾病公共靶點即交集靶點46個。其中癲癇疾病相關靶點1716個，“鉤藤-黃芩”靶點113個。

圖1 中藥-疾病靶點

3 中藥-有效成分-靶基因-疾病調控網絡的構建結果

運用Cytoscape3.8.2軟件構建的中藥-有效成分-靶基因-疾病關系網絡圖（見圖2），發現“鉤藤-黃芩”主要通過66種有效活性成分作用于46個靶點，這46個靶點基因可能對癲癇的發生發展產生影響。其中紅色六邊形代表癲癇（癲癇），藍色、黃色八邊形分別代表鉤藤、黃芩，紫色橢圓形代表鉤藤-黃芩的有效成分，綠色菱形代表“鉤藤-黃芩”與癲癇的共同靶點基因。

圖2 中藥-有效成分-靶基因-疾病關系網絡圖

4 PPI網絡構建結果

由圖3、圖4可知，利用Cytoscape3.8.2軟件，根據Degree值對46個靶點進行有序排列，排在前5的靶點依次為IL6、VEGFA、CASP3、EGFR、FOS，所以IL6、VEGFA、CASP3、EGFR、FOS最有可能成為核心靶點基因。

圖3 PPI網絡圖

圖4 PPI網絡核心基因條形圖

5 GO功能富集分析

最終得到107條GO生物學過程，均符合P≤0.05，“鉤藤-黃芩”治療癲癇的核心靶點GO功能富集分析見圖5（選取具有代表性的前20條），可知“鉤藤-黃芩”治療癲癇的核心靶點的GO功能主要包括DNA結合轉錄因子結合、RNA聚合酶II特異性DNA結合轉錄因子結合、突觸后神經遞質受體活性、藥物結合、神經遞質受體活性、血紅素結合、四吡咯結合、氧化還原酶活性、泛素蛋白連接酶結合、肽結合等。

圖5 GO功能富集分析柱狀圖

6 KEGG通路富集分析

共獲得106條KEGG信號通路，P均≦0.05，“鉤藤-黃芩”治療癲癇的KEGG通路富集分析結果見圖6，并構建通路-靶點關系網絡圖（取前30條，見圖7）。說明“鉤藤-黃芩”可能通過作用于脂質與動脈粥樣硬化信號通路、化學致癌-受體激活信號通路、流體剪應力與動脈粥樣硬化信號通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染信號通路、PI3K-Akt信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路等治療癲癇。

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖

圖7 通路-靶點關系網絡圖

討 論

1 潛在有效成分

本研究預測“鉤藤-黃芩”作用于癲癇的主要成分包括Rhynchophylline（鉤藤堿）、Baicalein（黃芩素）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）和 quercetin（槲皮素）。其中發揮抗癲癇作用的有效成分主要為鉤藤堿，其抗癇機制可能與氧化應激、免疫應答、神經遞質受體相關[10]。研究發現鉤藤堿不僅可減少內側內嗅皮質（mEC）Ⅲ層神經元凋亡，使mECⅡ層神經元的自發性癲癇樣放電終止，還可以通過抑制持續鈉電流和N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體電流來抑制神經細胞的過度興奮，從而有效降低大鼠動物模型癲癇發作程度[17]。黃芩素不僅可通過抗氧化應激、抗炎、抗神經細胞毒性和抑制神經元凋亡等分子機制對神經細胞起保護作用[18-20]，還可以抗癲癰并改善大腦認知功能，Xu Qian[21]等通過研究進一步證明黃芩素通過抑制氧化應激、抑制炎癥反應、調節糖皮質激素等多種途徑，從而減少癲癇大鼠海馬損害，改善大鼠認知功能。β-谷甾醇可通過多靶點、多途徑發揮其抗炎、抗氧化、神經細胞保護作用[22]，董雪等[23]研究證實了β-谷甾醇不僅對海馬神經元無毒性，還可以保護神經元并用于癲癇的治療。BDNF是腦源性神經營養因子之一，主要參與神經細胞分化，神經遞質合成及海馬的興奮性，癲癇發生時BDNF表達增加，槲皮素可干預并降低癲癇大鼠海馬區BDNF mRNA的上調，發揮其抗癲癇作用[24]。

2 關鍵基因靶點

本研究預測白細胞介素6（IL-6）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、胱天蛋白酶3（CASP3）、表皮生長因子受體（EGFR）、Fos等是“鉤藤-黃芩”治療癲癇的潛在基因靶點，其中EGFR、Fos與癲癇關系目前研究較少，IL-6、VEGFA、CASP3等相關靶點基因與癲癇的發生更為密切，IL-6是一種多效性的低分子量炎癥因子，為炎癥相關通路的上游介質，是體內炎癥反應的重要且敏感的標志物[25]。而癲癇發作的機制與炎癥密切相關，在某些特殊類型的癲癇綜合征（如Rasmussen綜合征）中，IL-6指標顯著上升[26-27]。諸多研究表明炎癥因子IL-6在癲癇起源區域以及播散區域的神經元、星形膠質細胞、小膠質細胞中過度表達，同時該區域炎性因子的受體蛋白上調，并通過細胞的自分泌或者旁分泌系統啟動相關的細胞信號傳導通路，進而導致癲癇的發作[28]。由此可見，炎癥因素是癲癇反復、長期發作的重要機制之一，因此通過檢測患者血清IL-6水平可很好的了解患者癲癇發作的炎性反應情況。VEGF主要由神經細胞、神經膠質細胞及炎癥細胞產生，具有增加血管通透性，促進內皮細胞增殖和血管生成以及保護神經組織等作用，大量研究表明，VEGF可直接作用于神經細胞，參與癲癇等神經系統疾病的病理過程[29]。癲癇發作后神經元和神經膠質細胞內的VEGF表達上調，可拮抗癲癇發作所導致的神經退化。另外，癲癇發作后可出現腦內血氧不足的情況，缺氧則易導致神經細胞受損，而VEGF能抗細胞凋亡[30]。Caspase家族在細胞凋亡的蛋白酶系統中發揮重要作用，其中Caspase-3的激活是神經細胞凋亡的標志。在癲癇病中，隨著神經元的凋亡，Caspase-3表達增加，丁春曉等[31]通過實驗研究進一步驗證了Caspase-3參與癲癇所致的神經元凋亡的過程。

3 KEGG分析

利用R語言預測 KEGG 通路，發現“鉤藤-黃芩”主要可能通過PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路、HIF-1信號通路等途徑發揮對癲癇的作用。

PI3K-Akt、TNF、IL-17、AGE-RAGE四條信號通路主要參與炎癥反應及細胞增殖與凋亡。PI3K-Akt信號通路是一條經典的抑制細胞凋亡與促進細胞存活的信號轉導途徑，PI3K為上游信號，可以激活并促使其下游AKT磷酸化的發生，并參與信號轉導的整個過程，促使細胞自噬凋亡、能量代謝與炎癥反應的發生。PI3K-Akt信號通路與炎癥反應呈負相關，激活PI3K/AKT信號通路可以在一定程度上抑制炎癥通路的激活及相關炎癥因子的釋放，從而減輕對神經細胞的損傷[32]。PI3K-Akt通路的激活在缺血缺氧性神經元損傷中起著重要作用，若在癲癇發作干預該信號通路，可以降低細胞凋亡的發生而減輕腦損傷[33-35]。李萍等[36]研究發現，PI3K/AKT信號通路與海馬組織細胞的凋亡密切相關，激活PI3K/AKT通路可抑制其下游凋亡信號通路的表達，進而抑制海馬區神經元的凋亡。TNF信號傳導通路的激活，可促進細胞生長、分化及凋亡，同時TNF在參與炎癥反應的調控過程能夠引起炎性病理損害，進而直接或間接的導致腦組織損傷[37]，TNF還能介導PI3K-Akt信號通路的激活，從而參與細胞凋亡的過程[38]。IL-17信號通路也同樣起介導炎癥反應和促進細胞凋亡的作用[39]，M.Lv通過動物實驗研究發現，在缺血再灌注損傷的大鼠大腦皮層中，在星形膠質細胞中釋放的IL-17可加速神經元的死亡，下調IL-17的生成可明顯使神經元的凋亡減少[40]。Mao等[41]觀察到IL-17在癲癇患者的腦脊液及血清中明顯增加，并且與癲癇發作強度呈正相關。已有研究證實RAGE也可干預一系列炎癥信號，同時RAGE也參與癲癇發作的炎癥反應[42]。由以上四條信號通路推測“鉤藤-黃芩”的有效成分可以通過調控炎癥反應及降低神經細胞凋亡以達到治療癲癇的作用。

在癲癇發作導致的腦損傷中，可出現腦缺血缺氧反應，而HIF-1信號通路在癲癇發作中可被啟動，并且在組織缺氧狀態下的表達增加以抑制缺氧狀態下神經干細胞的分化[43]。由此推測，“鉤藤-黃芩”還可能通過調節神經細胞在缺氧狀態下的適應性來治療癲癇。

結 語

綜上，本研究推測出“鉤藤-黃芩”可通過鉤藤堿、黃芩素、β-谷甾醇、槲皮素等66個有效活性成分調控IL6、VEGFA、CASP3、EGFR、FOS等46個癲癇病的疾病靶點，影響炎癥應答、凋亡過程的負調控等相關生物學過程及PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路、HIF-1信號通路等相關信號通路，從而發揮治療癲癇的作用，為后續深入研究“鉤藤-黃芩”治療癲癇提供了理論依據，為“鉤藤-黃芩”藥物的開發利用提供新思路，但仍需進一步加強試驗研究及驗證，為更深層次的充分挖掘奠定基礎。