結球生菜二氧化碳傷害預警指標的初步篩選

李恒偉，王慶國

結球生菜二氧化碳傷害預警指標的初步篩選

李恒偉，王慶國

（山東農業大學 食品科學與工程學院，山東 泰安 271018）

研究結球生菜在不同濃度二氧化碳中揮發性成分含量的變化情況，有助于篩選結球生菜二氧化碳傷害預警的特征性成分。將結球生菜放置于動態氣調環境中，通過氣相色譜-質譜分析其揮發性成分。實驗結果表明，結球生菜在0 ℃、氧氣的體積分數為3%條件下貯藏時，當環境中二氧化碳的體積分數大于6%時會受到傷害。在傷害和非傷害條件下，氯代十八烷、4-丙基甲苯、4-乙基甲苯、1,2,4-三甲基苯、乙酸十一酯、丁酸癸酯、己二酸單乙酯、己酸己酯、二苯乙烯、二烯丙基二硫醚的變化趨勢顯著不同，這些成分的變化可能與二氧化碳傷害有關。十四烷、乙酸十一酯和丁酸己酯的濃度在結球生菜開始受到傷害時出現了拐點式變化，這可作為結球生菜受到二氧化碳傷害的候選預警指標。

結球生菜；預警指標；氣相色譜-質譜法；動態氣調；揮發性成分

結球生菜（LDC）的水分含量（以質量分數表示）可達94%～96%[1]，其在常溫下放置2 d左右即出現葉片萎蔫、失水等現象，導致產品的品質下降[2]。采用0 ℃冷庫貯藏[3]和O2（體積分數3%）+CO2（體積分數2%）氣調貯藏，可延緩生菜葉片的褐變進程[4]，使生菜的貯藏期延長至42 d左右[5]。采用適當的低濃度O2/高濃度CO2氣調處理方法有助于延長結球生菜的貯藏期[6]，降低葉片的銹斑發生率，減少葉脈變為粉紅色和莖端切口變色等現象的發生，當CO2的體積分數高于5%時可引起高CO2傷害[7]。

生菜受到CO2傷害主要表現為球心褐變、葉片葉脈變粉等。通常認為，結球生菜主要會發生酶促褐變，由多酚氧化酶（PPO）等含銅末端氧化酶在酚類底物存在的條件下催化其氧化，形成黑色高分子聚合物[8]。當存在過氧化物時，植物細胞中存在的過氧化物酶（POD）可催化酚類、類黃酮的氧化聚合，最終導致植物組織發生褐變[9-10]。

在氣調貯藏中，二氧化碳濃度越高，保鮮效果越好，因此結球生菜常采用氣調冷庫或氣調包裝。動態氣調貯藏通過調節貯藏環境中氧氣與二氧化碳的濃度，以逼近果蔬耐受極限，從而延長其貯藏期。果蔬在貯藏期間的密堆易導致局部環境中的二氧化碳含量升高，而高濃度二氧化碳會帶來二氧化碳中毒的風險。如何盡量提高二氧化碳濃度，避免發生CO2傷害，以及如何識別早期CO2傷害，以減少貯藏損失已成為亟待解決的新問題。文中旨在通過GC-MS分析結球生菜在動態氣調中揮發性成分的變化情況，篩選出適合作為結球生菜氣調過程中二氧化碳傷害的預警成分，降低結球生菜貯藏中因二氧化碳傷害發生而造成的損失。

1 實驗

1.1 儀器設備

實驗的主要儀器設備見表1。

1.2 材料

實驗所用結球生菜分別于2019年3月和10月購于山東省泰安市菜市場，品種為碧綠，后運至山東農業大學食品科學與工程學院冷庫。所用實驗材料均要求大小均一、成熟度一致、無腐爛、無機械傷等。

1.3 方法

1.3.1 二氧化碳傷害點測定

取45個球心生菜，分為5組，分別進行固定氣體濃度氣調處理。氣調環境設定，溫度為0 ℃，O2的體積分數為3%，CO2的體積分數分別為2%、4%、6%、8%、10%，分別在貯藏5、10、20、30、35 d時進行觀察，并統計發病率。

1.3.2 動態氣調環境下揮發性成分的分析

1.3.2.1 氣調條件

取15顆結球生菜，放置于50 L水封氣調箱（放置于0 ℃冷庫內）中，設定氣調箱氣調的濃度（文中均以體積分數計）為O23%、CO22%。每隔48 h，氣調箱的CO2濃度上升2%，當CO2濃度分別達到2%、4%、6%、8%、10%時，對箱內揮發性成分進行取樣并測定。取樣前將氣調箱進出氣口密封8 h，使箱內氣體平衡，并將DVB/CAR/PDMS固相微萃取萃取頭插入氣相色譜儀進樣口，于250 ℃條件下老化2 h，老化結束后將萃取頭快速放置于氣調箱內對揮發性氣體成分進行萃取，在40 min后取出，并插入氣相色譜儀進樣口，于250 ℃下解吸5 min。重復3次平行實驗。

表1 實驗設備

Tab.1 Experimental equipment

1.3.2.2 氣相色譜-質譜條件

使用DB-WAX毛細管柱（30 m×0.25 mm× 0.5 μm），程序升溫至40 ℃保持3 min，先以8 ℃/min升至80 ℃保持1 min，后以9 ℃/min升溫至130 ℃保持1 min，再以6 ℃/min升溫至230 ℃保持12 min。進樣口溫度為250 ℃，不分流，載氣為氦氣（純度99.999%），柱流量為1.00 mL/min，離子源溫度為200 ℃，接口溫度為230 ℃，檢測器的相對電壓為0.1 kV，掃描范圍（/）為33～500。萃取頭在進樣口脫附時間為5 min。

1.4 數據分析

通過島津工作站GCMSsolution 4.20對氣相色譜質譜原始數據進行分析定性，使用Microsoft Excel 2013和Sigma Plot對數據進行分析。文中均以物質峰相對總峰面積變化進行分析，用相對含量（%）表示。

2 結果與分析

2.1 二氧化碳傷害濃度的確定

將結球生菜固定氣調環境中O2的濃度設定為3%，CO2的濃度分別設定為2%、4%、6%、8%、10%。實驗發現，隨著氣調時間的延長，CO2的濃度在6%及以上的氣調環境中生菜在貯藏第30天時球心由白變粉，開始出現褐變，氣調后期結球生菜球心的顏色加深，生菜外側梗葉開始出現褐變。由圖1可知，未出現CO2傷害的生菜球保持了較好的色澤，未出現褐變。這些結果表明，CO2的濃度6%為結球生菜二氧化碳的傷害點。

2.2 差異揮發性成分

實驗發現在結球生菜中，隨著氣調二氧化碳濃度的改變，產生的含量顯著變化的揮發性成分主要有21種物質，鑒定結果見表2，包括2種烷類、4種醇類、5種芳烴、5種酯類、3種烯類、2種醚類，具體含量變化趨勢詳見表3。

圖1 氣調貯藏30 d時未傷害濃度生菜（a、b）和發生傷害濃度生菜（c、d）

表2 結球生菜揮發性成分定性

Tab.2 Qualitative analysis of volatile components in head lettuce

隨著CO2濃度的上升，烷類物質含量呈先下降后上升的趨勢，在CO2濃度為6%時出現拐點式變化；醇類物質的總含量隨著CO2濃度的升高先下降后上升；芳香烴類物質的總含量隨CO2濃度的上升呈下降趨勢；酯類物質的含量隨CO2濃度的上升逐漸下降；烯類物質的總含量隨CO2濃度的上升相對穩定；醚類物質的含量隨CO2濃度的上升逐漸下降。

以上結果表明，高CO2濃度對于醇類、芳烴、酯類和醚類物質的產生具有抑制作用，而對烷類、烯類物質總含量沒有明顯的影響。

2.3 二氧化碳濃度對不同烷類成分含量的影響

在對結球生菜烷類的分析中發現了多種硅氧烷，硅氧烷為氣相質譜毛細管柱中填料隨升溫過程發生柱流失所產生的，與結球生菜CO2傷害無關。對結球生菜氣調中發生含量變化的烷類物質進行了分析，結果見表4，發生含量變化的烷類物質為十四烷、氯代十八烷。在傷害和非傷害濃度下，十四烷和氯代十八烷含量均出現明顯不同的變化趨勢，因此其變化可能與CO2傷害有關。

由圖2可知，結球生菜中十四烷含量隨著氣調CO2濃度的上升呈先下降后上升再下降的趨勢，并在傷害濃度點6%時出現拐點式變化；氯代十八烷在氣調CO2濃度為0%～6%時不存在，在CO2濃度為8%～10%時出現且含量穩定。在CO2濃度大于6%時結球生菜長期貯藏會發生CO2傷害，即氯代十八烷僅在高于CO2傷害起始濃度6%時升高，因此其預警CO2傷害具有一定滯后性。這些結果表明，十四烷可作為CO2傷害的候選預警指標。

表3 動態氣調對結球生菜各揮發性成分含量的影響

Tab.3 Effects of dynamic controlled atmosphere on the volatile component content of head lettuce

表4 動態氣調對結球生菜烷類成分含量的影響

Tab.4 Effects of dynamic controlled atmosphere on the alkanes content of head lettuce

圖2 結球生菜中十四烷和氯代十八烷揮發性成分的差異

Fig 2 Differences in tetradecane and chlorooctadecane content of head lettuce

2.4 二氧化碳濃度對不同醇類成分含量的影響

由表5可知，變動CO2氣調時結球生菜中發生含量變化的醇類物質為2-丁基辛醇、2,7-二甲基-1-辛醇、2-異丙基-5-甲基-1-庚醇和1-脫氧-d-麥芽糖醇。其中，2-丁基辛醇含量在CO2濃度為2%～8%時持續上升，在10%時下降，結球生菜在CO2傷害濃度（6%～10%）時會產生傷害，其物質含量先上升后下降，且在傷害濃度與未傷害濃度時含量近似；2,7-二甲基-1-辛醛在CO2濃度為2%時含量最大，在CO2濃度為4%～10%時含量保持穩定；1-脫氧-d-麥芽糖醇在CO2濃度為2%、8%、10%時存在，在CO2濃度為4%、6%時消失，表明該物質在傷害和未傷害濃度時均消失。由此可見，2-丁基辛醇、2,7-二甲基-1-辛 醇、1-脫氧-d-麥芽糖醇均不能作為CO2傷害的預警指標。

結球生菜中2-異丙基-5-甲基-1-庚醇的差異變化見圖3，其含量在CO2濃度為2%～6%時上升，CO2濃度為8%～10%時下降，結球生菜CO2傷害的傷害點濃度為6%，因此其含量變化遲于傷害濃度點，難以通過測定其含量及時判定是否發生CO2傷害，因此不適合作為結球生菜CO2傷害預警指標。

綜上所述，結球生菜醇類物質中不存在適合的CO2傷害預警指標性物質，2-異丙基-5-甲基-1-庚醇可能與CO2傷害有關。

表5 動態氣調對結球生菜醇類成分含量的影響

Tab.5 Effects of dynamic controlled atmosphere on the alcohols content of head lettuce

圖3 結球生菜中2-異丙基-5-甲基-1-庚醇的差異變化

2.5 二氧化碳濃度對結球生菜不同芳烴類成分含量的影響

由表6可知，隨著氣調過程中CO2濃度的增加，結球生菜中4-乙基甲苯、4-丙基甲苯、1,2,4-三甲基苯、奧苷菊環、丁羥甲苯成分含量會發生變化。其中，奧苷菊環在未傷害階段（CO22%～4%）含量略上升，在傷害階段（CO26%～10%）含量先上升后下降，且在未傷害階段其含量在傷害階段含量變化范圍內，難以通過測定其含量判斷是否處于傷害濃度下，因此不適合作為CO2傷害預警指標。丁羥甲苯物質含量變化趨勢與奧苷菊環類似，也不能作為CO2傷害預警指標。

由圖4可知，4-乙基甲苯含量隨氣調過程中CO2濃度的升高而逐漸下降，在未傷害濃度階段（CO22%～4%）含量高于傷害濃度階段（CO26%～10%），且含量變化趨勢在CO26%時存在拐點。由此可見，4-乙基甲苯的變化可能與CO2傷害有關。4-丙基甲苯含量的變化趨勢與4-乙基甲苯類似，在傷害濃度階段時存在變化拐點，且在未傷害濃度階段含量高于傷害濃度階段。1,2,4-三甲基苯含量隨CO2含量的升高而降低，在氣調CO2未傷害濃度時含量高于CO2傷害濃度時含量，因此這3種物質的變化與CO2傷害有關，但其含量變化拐點與二氧化碳傷害濃度重合，難以及時判斷二氧化碳傷害的發生，故不能作為CO2傷害預警的候選指標。

2.6 二氧化碳濃度對結球生菜不同酯類成分含量的影響

對生菜動態氣調過程中發生變化的酯類成分進行匯總，結果見表7。由表7可知，乙酸十一酯、丁酸癸酯、己二酸單乙酯含量均隨CO2濃度的升高而降低，己酸己酯含量隨CO2濃度的升高而上升，丁酸己酯含量隨CO2濃度的升高呈現先下降后上升趨勢。

如圖5所示，乙酸十一酯含量在動態氣調過程中，CO2未傷害階段含量高于CO2傷害階段，且未傷害期間含量基本穩定，傷害期間含量略微上升再下降，整體變化趨勢在CO2的體積分數為6%時存在拐點。由于結球生菜CO2傷害點濃度為6%，因此乙酸十一酯可作為CO2傷害預警的候選指標。

表6 動態氣調對結球生菜芳烴類成分含量的影響

Tab.6 Effects of dynamic controlled atmosphere on the aromatic hydrocarbon content of head lettuce

圖4 結球生菜中4-丙基甲苯、4-乙基甲苯和1,2,4-三甲基苯的差異變化

表7 動態氣調對結球生菜酯類成分含量的影響

Tab.7 Effects of dynamic controlled atmosphere on the esters content of head lettuce

丁酸癸酯含量在氣調期間變化顯著，結球生菜在未發生CO2傷害階段時含量高于發生CO2傷害階段。在未傷害階段，丁酸癸酯含量隨CO2濃度的升高而降低。在生菜發生CO2傷害（CO26%）時丁酸癸酯含量到達最低點，隨后基本穩定。由此可見，雖然丁酸癸酯與CO2傷害有關，但不能及時判斷二氧化碳傷害的發生，故不能作為結球生菜CO2傷害預警的候選指標。

由圖6可知，結球生菜在氣調過程中丁酸己酯的含量呈規律性變化。在未發生CO2傷害階段時，丁酸己酯含量基本穩定。在發生CO2傷害時，其含量先在CO2體積分數為6%時呈現突然下降，而后隨CO2濃度的升高而上升，因此丁酸己酯與CO2傷害相關，且適合作為CO2傷害的候選預警指標。

圖6 結球生菜中丁酸己酯、己酸己酯和己二酸單乙酯差異變化

己酸己酯含量在結球生菜未發生CO2傷害時不存在，在發生傷害的氣調過程中，其含量由CO2（6%）時的不存在到CO2（8%～10%）時的穩定存在，因此己酸己酯含量的變化對CO2傷害存在滯后性，可作為傷害發生后指標，但不適合作為CO2的預警指標。

己二酸單乙酯含量在生菜動態氣調中未發生CO2傷害時，隨著CO2濃度的升高而降低，其含量在發生傷害（CO26%）時達到最低點，隨后隨CO2濃度的升高而略有上升。己二酸單乙酯含量在未傷害階段高于傷害階段，且變化趨勢拐點與CO2傷害點一致，因此其與CO2傷害有關，但不可作為結球生菜CO2傷害預警的候選指標。

2.7 二氧化碳濃度對結球生菜不同烯類成分含量的影響

由表8可知，在結球生菜動態氣調過程中，發生含量變化的烯類物質為二苯乙烯、(Z,E)-α-法尼烯、α-法尼烯。其中，二苯乙烯隨CO2濃度的升高而降低；α-法尼烯含量隨CO2濃度的升高而上升；(Z,E)-α-法尼烯含量隨CO2濃度的升高呈現先下降后上升再下降的趨勢。由于(Z,E)-α-法尼烯含量在CO2傷害階段與未傷害階段的變化范圍重合，難以通過含量確定是否發生傷害，因此其不適合作為CO2傷害預警指標。

由圖7可知，二苯乙烯含量在未傷害階段隨著CO2濃度的上升而逐漸下降，到達傷害點（CO26%）時達到最小值，在此傷害階段其含量基本穩定不變，整體含量變化趨勢拐點與傷害濃度一致，且未傷害時含量高于傷害時含量。由此可見，其與CO2傷害顯著相關，但不能作為CO2傷害預警的候選指標。

α-法尼烯含量在CO2濃度為2%～6%時基本穩定，在傷害濃度（CO26%～10%）階段隨CO2濃度的升高而上升，但在未傷害階段與傷害階段（CO26%）時的含量近似，因此α-法尼烯含量的變化與CO2傷害存在滯后性，α-法尼烯可作為傷害發生指標，但不能作為預警指標。

2.8 二氧化碳濃度對結球生菜不同醚類成分含量的影響

由表9可知，結球生菜在動態氣調中發生變化的醚類成分為二烯丙基二硫醚和烯丙基硫醚。其中，二烯丙基二硫醚含量隨CO2濃度的升高呈逐漸下降的趨勢；二烯丙基硫醚含量隨CO2濃度的升高而先下降后降低，最終消失。由于二烯丙基硫醚含量的變化范圍在未傷害階段與傷害階段重合，難以通過含量判斷是否發生了CO2傷害，因此其不適合作為結球生菜CO2傷害的預警指標。

表8 動態氣調對結球生菜烯類成分含量的影響

Tab.8 Effects of dynamic controlled atmosphere on the olefins content of head lettuce

圖7 結球生菜中二苯乙烯和α-法尼烯差異變化

表9 動態氣調對結球生菜醚類成分含量的影響

Tab.9 Effects of dynamic controlled atmosphere on the ether content of head lettuce

由圖8可知，在未傷害階段二烯丙基二硫醚的含量隨著CO2濃度的升高而降低，至CO2體積分數為6%時達到拐點，其含量在傷害階段隨著CO2濃度的升高而略上升后下降。由于在未傷害階段時二烯丙基二硫醚的含量始終高于傷害階段時，因此其可作為結球生菜的CO2預警指標。

3 討論

丁酸癸酯、己二酸單乙酯是木瓜[11]、黃酸棗[12]等果蔬的天然香氣成分，在結球生菜中亦發現其存在。此次實驗發現，在結球生菜中丁酸癸酯、己二酸單乙酯的含量與二氧化碳傷害存在顯著相關；二烯丙基二硫醚具有大蒜的香氣[13]，屬于揮發性含硫氣體成分。有前人文獻報道，二烯丙基二硫醚含量可以判斷松露的新鮮程度[14]。在此次實驗中發現，二烯丙基二硫醚含量的變化與二氧化碳的濃度存在顯著相關；4-丙基甲苯、4-乙基甲苯、1,2,4-三甲基苯成分常見于多種果蔬中[15-17]，其含量隨品種、品系的不同存在差異。在實驗中發現，結球生菜中4-丙基甲苯、4-乙基甲苯、1,2,4-三甲基苯的含量均隨著二氧化碳傷害的發生而出現下降趨勢；二苯乙烯是多種果蔬中常見的香氣成分，此實驗中其含量隨二氧化碳濃度的升高而下降。

圖8 結球生菜中二烯丙基二硫醚的差異變化

在0 ℃下貯藏的結球生菜，在氣調環境中二氧化碳體積分數大于等于6%時出現二氧化碳傷害，其二氧化碳傷害顯著影響揮發性成分的產生，氯代十八烷、4-丙基甲苯、4-乙基甲苯、1,2,4-三甲基苯、乙酸十一酯、丁酸癸酯、己二酸單乙酯、己酸己酯、二苯乙烯、二烯丙基二硫醚的含量在CO2（6%）傷害前后存在明顯拐點，其成分含量對二氧化碳濃度的變化較敏感，與二氧化碳傷害存在顯著相關性。十四烷、乙酸十一酯和丁酸己酯含量CO2體積分數為6%時存在拐點式變化，因此可作為結球生菜CO2傷害的候選預警指標。

4 結語

基于結球生菜在動態氣調中揮發性成分含量的變化情況，結合二氧化碳傷害濃度點研究發現，十四烷、乙酸十一酯和丁酸己酯是最有可能預測結球生菜二氧化碳傷害發生的預警指標。該結論為預警結球生菜氣調貯藏中二氧化碳傷害提供了新的信息，也為結球生菜氣調環境控制提供了更為準確的參數，對實際應用具有一定指導意義。結球生菜二氧化碳傷害對香氣成分變化的影響也有待進一步分析與研究，以便為探明生菜二氧化碳傷害機理和代謝合成通路提供參考。

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Preliminary Screening of Warning Indexes for Carbon Dioxide Damage of Head Lettuce

LI Heng-wei, WANG Qing-guo

(College of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Shandong Taian 271018, China)

The work aims to study the changes in the content of volatile components of head lettuce in carbon dioxide of different concentrations, and help to screen the characteristic components of head lettuce for warning of carbon dioxide damage. The head lettuce was stored in a dynamic controlled atmosphere, and the volatile components were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry. The experimental results showed that head lettuce stored at 0 ℃ and 3% oxygen was damaged in an environment of 6% (volume fraction) carbon dioxide and above. Under harmful and non-harmful conditions, chlorooctadecane, 4-propyl toluene, 4-ethyl toluene, 1,2,4-trimethylbenzene, undecyl acetate, decyl butyrate, adipic acid mono Ethyl acetate, hexyl hexanoate, stilbene, and diallyl disulfide showed significantly different trends, and the changes in these components may be related to carbon dioxide damage. Tetradecane, undecyl acetate and hexyl butyrate show inflection point changes at the initial injury concentration, which can be used as candidate warning indicators for the occurrence of carbon dioxide injury in head lettuce.

head lettuce; warning indicators; gas chromatography-mass spectrometry; dynamic controlled atmosphere; volatile components

TS255.3

A

1001-3563(2022)07-0035-10

10.19554/j.cnki.1001-3563.2022.07.005

2021-07-21

山東省泰山產業領軍人才項目（LJNY201702）

李恒偉（1994—），男，山東農業大學碩士生，主攻果蔬采后貯藏與加工。

王慶國（1965—），男，山東農業大學教授、博導，主要研究方向為果蔬采后貯藏與加工。

責任編輯：彭颋