益脾養肝方對大鼠肝癌前病變肝干細胞惡性轉化的影響和作用機制

鞠 迪， 李 汨， 韓 曼， 房冰瑩， 閆曙光， 李京濤

1 陜西中醫藥大學 a.陜西省中西醫結合心血管病防治重點實驗室, b.基礎醫學院， 陜西 咸陽 712046；2 陜西中醫藥大學附屬醫院 肝病一科， 陜西 咸陽 712000

肝細胞癌是人類最常見的惡性腫瘤之一[1]，多數患者發現時已至晚期，治療預后差，5年內復發率高。肝癌前病變是肝纖維化、肝硬化發展為肝癌的過渡階段[2]，其進展為惡性腫瘤的風險顯著增加，如果能及時阻斷這一惡變過程，就能阻止肝癌的發生。但目前肝癌前病變的發生機制仍未闡明，臨床也缺乏相應的藥物。因此，尋找控制或逆轉肝癌前病變的分子機制具有重大理論意義。PI3K/Akt信號通路在維持干細胞增殖和多方向分化具有重要作用，PI3K/Akt信號通路的異常活化在肝干細胞周期失調、過度增殖過程中扮演重要角色[3-4]，可作為治療慢性肝病的重要靶標[5]。益脾養肝方是陜西省名中醫常占杰教授沿用多年的防治肝硬化進展的臨床常用方，前期研究已證實該方能有效改善肝癌前病變患者臨床癥狀[6]、抑制二乙基亞硝胺(DEN)誘發的大鼠肝癌前病變[7-12]，但作用機制尚不十分清楚。本研究旨在探討益脾養肝方對肝干細胞惡性轉化的影響，探討其是否通過調控PI3K/Akt/mTOR通路抑制肝干細胞的惡性轉化從而發揮抗肝癌前病變的作用，為該方的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠35只，體質量180～200 g，購自成都達碩生物科技有限公司，動物生產許可證號：SCXK(川)2020-24，使用許可證編號:SYXK(川)2019-189，實驗動物正常飼養于溫度20 ℃～24 ℃、相對濕度50%～60%環境，自由進食和飲水。

1.1.2 藥物及制備 益脾養肝方由白術、黨參、熟地、鱉甲、枸杞、半枝蓮、郁金、姜黃、白花蛇舌草組成，于陜西中醫藥大學附屬醫院藥劑科購買并制成每克生藥含量為5 g的凍干粉，置4 ℃冰箱封存。使用時溶于100 ℃沸水，配制成中藥湯液濃度為1.0 g/mL。護肝片由黑龍江葵花藥業股份有限公司生產。

1.1.3 試劑及耗材 DEN購自美國Sigma公司；AST、ALT、 Alb測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；總RNA提取試劑盒購自天根生化技術有限公司；反轉錄試劑盒和SYBR?Green qPCR SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物有限公司；Akt、Phospho-Akt(Ser473)、PI3K p85、mTOR、Beta Actin抗體購自proteintech公司；Phospho-PI3K p85 (Tyr458) /p55 (Tyr199)、Phospho-mTOR(Ser2448)抗體購自Cell Signaling Techenology公司；谷胱甘肽S轉移酶(GST3/GST pi)抗體購自abcam公司；OV6抗體購自R&D Systems公司；山羊抗兔IgG/HRP、山羊抗小鼠IgG/HRP抗體購自西安壯志生物科技有限公司；ECL顯影液購自武漢博士德生物工程有限公司；兔SP試劑盒、鼠SP試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.1.4 主要儀器 冷凍型高通量組織研磨器(寧波新芝生物科技股份有限公司)、800TS吸收光酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)、超微量分光光度計(賽默飛世爾科技有限公司)、實時定量PCR(RT-PCR)儀(賽默飛世爾科技有限公司)、輪轉式切片機(德國Leica公司)、YD-AB型攤烤片機、YD-6L型生物組織包埋機(金華市益迪醫療設備有限公司)。BX41/60型光學顯微鏡(日本Olympus公司)、化學發光凝膠成像系統(基因有限公司)，BS224S型電子分析天平(德國Sariorins公司)。

1.2 動物分組 35只大鼠隨機分為4組：正常對照組(空白組)5只，DEN模型組(模型組)10只，DEN+護肝片組(護肝片組)10只，DEN+益脾養肝方組(益脾養肝方組)10只。除空白組外，其余各組均以0.5 mL/100 g的DEN腹腔注射，每周50 mg/kg(2次/周，即1次/84 h)，連續給藥16周；空白組：給予同等條件的飼養與抓捕，同等時間點注射等量生理鹽水。造模次日起益脾養肝方組給予濃度為1.0 g/mL的益脾養肝方藥液灌胃，護肝片組按 921 mg/kg大鼠體質量灌胃，空白組、DEN組大鼠給予等量生理鹽水灌胃。灌胃持續16周，1次/d。實驗過程中，每周測量記錄大鼠體質量。待實驗周期結束，全部大鼠用10%的水合氯醛腹腔注射(0.3 mL/100 g)，待大鼠麻醉后腹主動脈取血，收集血清，置于-80 ℃冰箱備用；取各組大鼠肝臟左葉約1 cm×1 cm×1 cm浸入4%多聚甲醛中，常溫固定過夜后制作石蠟切片；取肝右葉組織約1 cm×1 cm×1 cm提取總蛋白和總RNA；其余肝組織置于-80 ℃冰箱備用。

1.3 研究方法

1.3.1 肝臟指數 采集大鼠肝臟，測量肝重比(肝臟指數)。肝臟指數(%)=肝臟重量/大鼠體質量×100%。

1.3.2 肝功能指標的檢測 采集大鼠腹主動脈血，收集血清，檢測ALT、AST和Alb水平。

1.3.3 肝臟病理組織觀察 病理組織學采用蘇木素-伊紅(HE)染色和天狼星紅染色觀察各組大鼠肝損傷情況和膠原沉積情況，取各組大鼠肝臟左葉約1 cm×1 cm×1 cm浸入4%多聚甲醛中，常溫固定過夜后制作石蠟，3 μm切片，經脫蠟、水化、染色、分化、透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察大鼠肝組織形態結構變化，隨機選取3個視野進行圖片采集，用Image-Pro Plus 6.0 軟件對肝臟組織膠原沉積光密度值進行半定量分析。

1.3.4 免疫組化檢測GST-Pi及OV6表達 石蠟切片經脫蠟、水化、抗原修復冷卻后，3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶的活性，0.05%BSA封閉，一抗4 ℃孵育過夜，PBS清洗，二抗室溫孵育2 h，PBS清洗，三抗室溫孵育30 min，PBS清洗，DAB顯色，蘇木素復染、脫水透明后封片。光學顯微鏡下隨機選取3個視野進行圖片采集，用Image-Pro Plus 6.0 軟件對肝組織目的蛋白光密度值進行半定量分析。

1.3.5 Western Blot 檢測 取50 mg肝組織加入蛋白裂解液，使用冷凍型高通量組織研磨器研磨提取總蛋白，BCA法檢測總蛋白濃度；取20 μg蛋白上樣后電泳，轉膜，封閉。一抗Akt、Phospho-Akt(Ser473)、PI3K p85、mTOR、Beta Actin、Phospho-PI3K p85(Tyr458)/p55(Tyr199)、Phospho-mTOR(Ser2448)4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，加ECL顯影液曝光。Image J分析計算條帶的灰度值。

1.3.6 RT-PCR檢測EpCAM、CD133和CD90表達 取50 mg肝組織，按RNA提取試劑盒說明提取總RNA，反轉錄為cDNA。根據美國國立生物技術信息中心(NCBI)公布的大鼠基因序列，應用Primer 5軟件設計引物(表1)，以cDNA為模板進行RT-PCR。采用三步法進行PCR擴增，反應結束后根據各樣本CT值，利用2-ΔΔCT計算各組基因的相對表達量。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequences used in RT-PCR

2 結果

2.1 大鼠肝癌前病變的病理變化 造模過程中，空白組大鼠無死亡，余5只；模型組死亡1只，余9只；護肝片組死亡1只，余9只；益脾養肝方組無死亡，余10只。肉眼觀察：空白組大鼠肝臟表面光滑，質地柔軟，無明顯病變出現；與空白組相比，模型組大鼠肝臟表面可見大量結節，分布不均且數量不等，部分肝組織可伴有淤血及腫塊；益脾養肝方組和護肝片組肝臟表面粗糙，結節數量及程度較模型組減輕，其中益脾養肝方組改善作用更強。

HE染色顯示：空白組大鼠肝細胞大小均一，排列整齊，以中央靜脈為軸心呈放射狀排列形成肝索，肝小葉結構完整；模型組大鼠肝細胞變性壞死，體積增大，核質比增加，肝索結構紊亂，并有廣泛的炎性細胞浸潤，形成大量假小葉；益脾養肝方組和護肝片組較模型組肝臟病理形態顯著改善，變性壞死細胞明顯減少，核質比相對降低，假小葉相對較少，炎性細胞浸潤減少。天狼星紅染色顯示: 空白組匯管區血管有少量膠原沉積；模型組可見大量纖維條索將肝組織分割形成假小葉，膠原沉積顯著增多(P<0.05)；益脾養肝方組和護肝片組纖維條索明顯減少，肝臟分隔減少，膠原沉積顯著減少(P值均<0.05)，益脾養肝方組比護肝片組更明顯(圖1，表2)。

表2 各組大鼠肝組織中膠原沉積半定量分析Table 2 Semi-quantitative analysis of collagen depositionin liver tissues of rats in various groups

2.2 大鼠肝臟指數和肝功能的比較 與空白組相比，模型組肝臟指數及血清中ALT、AST水平顯著升高(P值均<0.01)，Alb顯著降低(P<0.01)； 與模型組相比，益脾養肝方組和護肝片組肝臟指數及血清中ALT、AST水平明顯下降(P值均<0.01)，Alb明顯升高(P值均<0.01)。與護肝片組相比，益脾養肝方組肝臟指數及血清中ALT、AST水平明顯下降(P值均<0.01)，Alb水平明顯升高(P<0.01)。提示益脾養肝方和護肝片對DEN誘導的肝癌前病變模型大鼠肝損傷具有保護作用，且益脾養肝方組效果比護肝片組顯著(表3)。

圖1 肝組織HE染色和天狼星紅染色(×100)Figure 1 Images of liver sections stained by Hematoxylin-Eosin (HE) and Sirius Red staining(×100)

表3 各組大鼠血清ALT、AST、Alb和肝臟指數比較Table 3 Comparison of ALT, AST, Alb and liver index in various groups

2.3 大鼠肝癌前病變組織中GST-Pi、OV6蛋白水平的變化 免疫組化結果顯示，GST-Pi陽性灶主要分布在細胞胞漿中，呈圓形或不規則形棕黃色團塊。空白組未見明顯陽性表達；與空白組相比，模型組在匯管區周圍及肝小葉內可見棕黃色陽性灶，且顏色較深，GST-Pi呈強陽性表達(P<0.05)；與模型組相比，益脾養肝方組和護肝片組大鼠肝組織GST-Pi表達顯著下調(P值均<0.05)；與護肝片組相比，益脾養肝方組大鼠肝臟組織GST-Pi表達明顯降低(P<0.05)。上述結果提示益脾養肝方和護肝片可抑制大鼠肝癌前病變的形成，且益脾養肝方組比護肝片組顯著(圖2，表4)。

免疫組化結果顯示，OV6蛋白陽性灶主要分布在纖維間隔周圍，呈棕黃或棕褐色。空白組未見明顯陽性表達；與空白組相比，模型組OV6 表達顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，益脾養肝方組和護肝片組大鼠肝組織OV6表達顯著下調(P值均<0.05)；與護肝片組相比，益脾養肝方組大鼠肝組織OV6表達明顯降低(P<0.05)。上述結果提示益脾養肝方和護肝片可抑制大鼠肝癌前病變組織中肝干細胞標志物OV6的表達，且益脾養肝方組比護肝片組顯著(圖2，表4)。

注：GST-Pi免疫組化染色(×200)，OV6免疫組化染色(×400)。

表4 各組大鼠肝組織中OV6及GST-Pi含量半定量分析Table 4 Semi-quantitative analysis of OV6 and GST-Piin liver tissues of rats in various groups

2.4 益脾養肝方對大鼠肝癌前病變組織中EpCAM、CD133、CD90表達的影響 與空白組相比，模型組大鼠肝組織EpCAM、CD133和CD90 mRNA表達水平均顯著增高(P值均<0.05)；與模型組相比，益脾養肝方組和護肝片組大鼠肝組織EpCAM、CD133和CD90 mRNA表達水平均顯著降低(P值均<0.05)；與護肝片組相比，益脾養肝方組EpCAM、CD133和CD90 mRNA表達水平均顯著降低(P值均<0.05)。上述結果提示益脾養肝方和護肝片可抑制大鼠肝癌前病變組織中肝癌干細胞標志物EpCAM、CD133和CD90的表達，且益脾養肝方組比護肝片組顯著(表5)。

2.5 益脾養肝方可抑制大鼠肝組織PI3K/Akt /mTOR信號通路相關蛋白的磷酸化 Western Blot結果顯示,與空白組相比，模型組大鼠肝組織p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白的表達均顯著升高(P值均<0.05)；與模型組相比，益脾養肝方組和護肝片組大鼠肝組織p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白的表達均顯著降低(P值均<0.05)；與護肝片組相比，益脾養肝方組大鼠肝組織p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白的表達均顯著降低(P值均<0.05)。上述結果提示益脾養肝方和護肝片可抑制肝癌病變模型大鼠PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白PI3K、Akt、mTOR的磷酸化，且益脾養肝方組比護肝片組顯著(圖3，表6)。

圖3 PI3K/Akt/mTOR在DEN誘導肝癌前病變組織中的表達

3 討論

癌前病變是一種臨床常見的組織學改變，其進展為惡性腫瘤的風險高，及時阻斷癌前病變的發生、發展，是癌癥防治工作的重點。肝癌前病變是肝纖維化、肝硬化發展為肝癌的過渡階段，目前肝癌前病變的發生機制尚未闡明，臨床也缺乏相應的藥物。隨著大量且深入的臨床療效觀察，中醫藥在防治肝癌及肝癌前病變方面展現出獨特優勢，可降低肝癌發生率、延緩疾病進程[13-15]。本著“未病先防”“既病防變”的思想，從整體觀念出發，辨病與辨證相結合，以求能夠更加客觀把握疾病發生發展規律，為肝癌前病變的治療研究提供了新思路[16]。益脾養肝方是陜西省名中醫常占杰教授沿用多年的防治肝硬化進展的臨床常用方，由黨參、白術、熟地、枸杞、姜黃、鱉甲、郁金、半枝蓮、白花蛇舌草九味藥物組成，具有益脾養肝、行氣活血、解毒散結的功效。臨床研究[6]表明該方能有效改善肝癌前病變患者臨床癥狀，緩解高危轉癌風險患者的患癌率。已完成的實驗研究[7-12]證實益脾養肝方顯著減輕DEN誘發的大鼠肝癌前病變組織的病理形態，通過下調PCNA和GGT蛋白的表達，發揮抗細胞增殖、抗細胞氧化損傷的作用；通過抑制肝組織IL-6、TNFα、TLR4、NF-κB、STAT3等炎癥相關因子的表達，降低炎癥纖維化微環境對肝實質細胞的刺激作用；可提高CD3+、CD4+T淋巴細胞數量，降低CD8+T淋巴細胞數量，調控T淋巴細胞亞群數目和比例，增強機體免疫功能；可上調抑癌因子miRNA-124并下調致癌因子miRNA-221的表達，從而延緩肝癌前病變進展[7-12]。

表5 各組大鼠肝組織中EpCAM、CD133和CD90 mRNA相對表達量比較Table 5 Comparison of mRNA expression levels of EpCAM, CD133 and CD90 in various groups

表6 各組大鼠肝組織中PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白半定量分析Table 6 Semi-quantitative analysis of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway-related protein in liver tissues of rats in various groups

GSTs是一組與機體解毒作用有關的酶類，其中GST-Pi可作為肝癌前病變的標志，是肝癌研究中檢測癌前病變的常用指標[17]。GST-Pi在正常大鼠肝臟基本無活性，出現癌前病變時，肝細胞的去分化和肝干細胞的異常分化與增生可促進GST-Pi的表達。ALT、AST、Alb是評價肝功能的常用指標，本實驗結果發現益脾養肝方可抑制肝癌前病變大鼠血清中ALT和AST的升高，提高Alb的水平，且明顯改善大鼠肝組織病理形態，減少膠原沉積及假小葉的形成，降低肝癌前病變標志物GST-Pi的表達，表明益脾養肝方可明顯抑制肝癌前病變的進展，與前期研究相符。

肝癌前病變的產生涉及炎癥纖維化微環境的形成、肝癌干細胞的產生及二者相互作用并最終形成結節性病變。其中肝癌干細胞的產生是整個過程中最關鍵的步驟之一[18]。以往認為肝癌干細胞來源于成熟肝細胞的去分化，而越來越多的實驗數據表明肝癌干細胞來源于肝干細胞的惡性轉化[19]。肝干細胞主要存在于肝膽管末端Hering管，又稱卵圓細胞，是慢性肝病患者肝臟中出現的一種具有多向分化潛能的原始細胞[20]。在肝細胞嚴重受損或分裂增生受到抑制時，肝干細胞可向肝細胞和膽管上皮細胞多向分化；當致癌因素存在時，可誘導肝干細胞活化增殖與惡性轉化為肝癌干細胞[21]。已有研究報道PI3K/Akt信號通路在肝癌前病變進展中發揮重要作用。PI3K是細胞生長、增殖和遷移調控的第二信使，可通過下游Akt信號分子共同維持干細胞增殖和多方向分化。PI3K/Akt信號通路的異常活化在肝干細胞周期失調、過度增殖過程中扮演重要角色[3-4]，在肝纖維化、肝硬化和肝癌的發生發展中發揮重要作用，可作為治療慢性肝病的重要靶標[5]。葛根素6-O-木糖苷[22]可通過抑制PI3K/AKT/mTOR降低肝癌細胞活力、增殖和干性，并促進了肝癌細胞自噬和線粒體依賴的凋亡；苦參堿衍生物[23]通過抑制PI3K/AKT信號通路減少肝癌干細胞富集；丹參多酚酸鹽[24]通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路降低α-SMA、Collagen Ⅰ、CollagenⅢ的表達發揮抗纖維化的作用。本研究顯示益脾養肝方可抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路中PI3K、Akt、mTOR蛋白的磷酸化，繼而改善肝癌前病變。

本研究的創新之處在基于肝干細胞惡性轉化在肝癌前病變中的作用，選擇臨床療效確切的名中醫經驗方作為研究對象，從肝癌前病變出發，符合中醫治未病理論。但益脾養肝方對肝干細胞惡性轉化的影響尚未完全闡明，本研究結果顯示益脾養肝方可降低肝干細胞標志物OV6的表達，同時可顯著抑制肝癌干細胞標志物EpCAM、CD133、CD90的表達，表明益脾養肝方可抑制肝干細胞向肝癌干細胞的惡性轉化，在一定程度上闡明了益脾養肝方抗肝癌前病變的作用機制。

綜上所述，益脾養肝方可抑制大鼠肝癌前病變組織中肝干細胞惡性轉化，其機制可能與調控PI3K/Akt/mTOR信號通路有關。本研究結果為益脾養肝方抗肝癌前病變的臨床應用提供了理論基礎，也為益脾養肝方抗肝癌前病變作用機制的深入探討提供了一定的實驗依據。

倫理學聲明：本研究方案于2019年3月13日經由陜西中醫藥大學倫理委員會審批，批號：SUCMDL20211115001，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：鞠迪負責課題設計，資料分析，撰寫論文；李汨、韓曼負責收集數據，修改論文；房冰瑩負責整理數據，統計分析；李京濤、閆曙光負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。