海人酸致癇大鼠顳葉、海馬區(qū)多藥耐藥基因1、P-糖蛋白的表達(dá)及相互關(guān)系

晏玉奎 胡建琴 王莊 張冰 鐘婧 姜亦珍

目前，癲癇治療的主要方法仍是藥物治療。據(jù)統(tǒng)計(jì)，高達(dá)30%的癲癇患者服用各種抗癲癇藥物（antiepileptic drugs,AEDs）后癲癇仍持續(xù)發(fā)作，表現(xiàn)出多藥耐藥現(xiàn)象，進(jìn)一步發(fā)展為難治性癲癇或耐藥性癲癇（refractory epilepsy,RE）[1]。目前RE的機(jī)制尚不明確，有研究認(rèn)為多藥耐藥現(xiàn)象與大腦毛細(xì)血管內(nèi)皮上多藥外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白高表達(dá)有關(guān)，其作用是與細(xì)胞內(nèi)脂溶性藥物結(jié)合并將其泵出，使腦實(shí)質(zhì)內(nèi)藥物水平降低，從而導(dǎo)致癲癇耐藥。多藥外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分為3種亞型：P-糖蛋白（P-glycoprotein,Pgp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白、乳腺癌耐藥蛋白，其中Pgp是一種跨膜蛋白，由人類多藥耐藥基因1（multidrug resistance gene1,MDR1）編碼，與RE關(guān)系研究也較為深入[2]。有報(bào)道海人酸（kainic acid，KA）致慢性顳葉癲癇模型可對多種AEDs耐藥，是研究人類RE的理想模型[3]，因此，本研究探討癲癇大鼠顳葉、海馬區(qū)MDR1 mRNA、Pgp的表達(dá)及其相互關(guān)系，以期為開發(fā)新的治療方法或藥物提供依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選擇健康清潔級雄性SD大鼠50只（購于上海斯萊克公司），體重200～220 g，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度18～24℃，濕度60%，日光照射時間12 h/d，自由攝入水分和食物。本研究經(jīng)過醫(yī)院動物倫理委員會審批通過（批準(zhǔn)文號：20210709），操作嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》的相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑和儀器 KA由美國Sigma公司提供，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real time PCR試劑盒均由日本TaKaRa公司提供，瓊酯糖由美國Sigma公司提供；Trizol由美國Invitrogen公司提供，β-actin的引物和探針由上海皓嘉科技發(fā)展有限公司提供，Pgp鼠單克隆抗體C219由英國Abcam公司提供，即用型辣根過氧化物酶試劑盒以及非生物素廣譜二抗均由上海長島生物技術(shù)有限公司提供，腦立體定向儀由安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司提供，熒光定量PCR儀和Real time PCR專用96孔板膜由ABI公司提供。所需引物和探針由南京驥驁生物技術(shù)有限公司合成，β-actin：上游5'-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3'，下游 5'-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3'，MDR1：上游 5'-CTCTCGCTGCTATCATCCACGGAACC-3'，下游 5'-ACTGCTGTCGCTGACGGTCTGTGTA-3'。

1.3 方法

1.3.1 大鼠癲癇模型建立及行為學(xué)判定 采用10%水合氯醛（0.1 g/ml）按4 ml/kg腹腔注射麻醉，乙醇棉球局部消毒皮膚，剪除大鼠頭皮毛發(fā)，沿正中線向后剪開頭皮，用血管鉗將頭皮向兩側(cè)拉開并固定，分離皮下組織，充分暴露顱骨，參考《大鼠腦立體定位圖譜》[4]，選擇海馬區(qū)為穿刺點(diǎn)：X軸在前囟左側(cè)方5.0 mm，Y軸在前囟后方5.0 mm，Z軸在硬膜下方5.0 mm。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為觀察組（30只）和對照組（20只），觀察組將預(yù)先裝有2 μl KA（含KA 1.0 μg）的微量注射器沿穿刺點(diǎn)進(jìn)針，深度達(dá)5.0 mm，緩慢注入液體，注射時長0.5 h。對照組采用同樣方法于穿刺點(diǎn)注射2 μl 0.9%氯化鈉注射液。注射完畢后再次采用乙醇棉球局部消毒皮膚，全層縫合頭皮，以碘伏消毒皮膚，最后腹腔注射0.5 ml青霉素預(yù)防感染。觀察組大鼠癲癇發(fā)作行為學(xué)判定采用Racine標(biāo)準(zhǔn)（多次發(fā)作按最大發(fā)作程度計(jì)算），Ⅰ級：面部的肌肉抽搐；Ⅱ級：以點(diǎn)頭運(yùn)動為主的頸部肌肉抽搐；Ⅲ級：單側(cè)前肢的陣攣、抽搐；Ⅳ級：雙側(cè)前肢陣攣、抽搐伴身體立起；Ⅴ級：雙側(cè)后肢強(qiáng)直，身體背曲強(qiáng)直，跌倒伴全身陣攣，分級達(dá)到Ⅲ～Ⅴ級發(fā)作為造模成功。觀察組因麻醉意外死亡2只，余28只大鼠在注射KA后30～180 min內(nèi)出現(xiàn)癲癇發(fā)作，反復(fù)發(fā)作持續(xù)1～3 h，其中6只因急性癥狀性癲癇持續(xù)狀態(tài)而死亡，共成功建模22只。對照組20只均存活。兩組大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)、觀察1個月，以充分觀察大鼠癲癇發(fā)作時間及頻率，其中觀察組平均每周觀察到1～3次癲癇發(fā)作，對照組無癲癇發(fā)作。

1.3.2 顳葉、海馬區(qū)組織Pgp表達(dá)水平檢測 兩組大鼠均采用10%水合氯醛按4 ml/kg腹腔注射麻醉、快速斷頭取腦，取出后立即用10%中性甲醛繼續(xù)固定腦組織，采用梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，脫蠟，用3% 過氧化氫處理5 min，加入稀釋度1∶50鼠 Pgp單克隆抗體C219，4℃過夜，按二抗試劑盒推薦的方法進(jìn)行免疫組化染色，辣根過氧化物酶顯色5～10 min后水洗、分化、復(fù)染、脫水、透明、封片，采用光學(xué)顯微鏡采集系統(tǒng)分析顳葉、海馬區(qū)組織病理切片，對每張病理切片選取3個不重復(fù)的陽性視野，計(jì)算每個視野的Pgp表達(dá)灰度值（反映Pgp的表達(dá)水平）。

1.3.3 顳葉、海馬區(qū)組織MDR1 mRNA表達(dá)水平檢測 顳葉、海馬區(qū)組織總RNA提取：分別取大鼠顳葉、海馬區(qū)組織30 mg，加 1 ml Trizol勻漿，加氯仿0.2 ml混勻、離心，使溶液分成3相，吸取上清液，加等體積異丙醇混勻、再次離心，棄上清液，加冰預(yù)冷的75%乙醇、離心，棄上清液，溶于20 μl 0.1%焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate,DEPC）水。取上述RNA液 1 μl，加入 99 μl 0.1%DEPC 水，采用紫外分光光度儀確定RNA的純度及RNA的水平，將OD值（A260/A280）維持在1.8～2.0。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的方法合成cDNA，體積為20 μl的反應(yīng)體系包括MgCl24 μl，反轉(zhuǎn)錄 10×緩沖液 2 μl，dNTP 混合物 2 μl，總 RNA 1 μl，Oligo引物 1 μl，Taq 酶 1 U，無核酸酶水。反應(yīng)條件為37℃ 15 min，85℃ 5 s，放置冰上5 min。采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測MDR1 mRNA表達(dá)：使用ABI 7300熒光PCR儀進(jìn)行兩步法擴(kuò)增，預(yù)變性95℃ 10 s，PCR反應(yīng)95℃ 5 s，60℃ 31 s，循環(huán)45次。體積為20 μl的反應(yīng)體系包括 cDNA模板4 μl，上、下游引物各 1 μl，Premix Ex TaqTM10 μl，熒光探針溶液 1 μl，ROX 液 0.5 μl，無核酸酶水。MDR1 mRNA與β-actin同步擴(kuò)增，自動得出循環(huán)閾值（cycle threshold,Ct）值，反應(yīng)結(jié)束后，由軟件自動得出熒光反應(yīng)曲線以及每個標(biāo)本反應(yīng)體系的擴(kuò)增效率及Ct值。采用2-ΔΔCt法計(jì)算待測樣本中MDR1 mRNA拷貝數(shù)，反映MDR1 mRNA表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；MDR1 mRNA和Pgp表達(dá)水平的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠顳葉、海馬區(qū)Pgp表達(dá)灰度值比較 見表1。

表1 兩組大鼠顳葉、海馬區(qū)Pgp表達(dá)灰度值比較

由表1可見，觀察組顳葉、海馬區(qū)Pgp的表達(dá)灰度值高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。兩組大鼠顳葉、海馬區(qū)典型病理切片見圖1-4。

圖1 觀察組顳葉病理切片（免疫組化染色，×400）

圖2 對照組顳葉病理切片（免疫組化染色，×400）

圖3 觀察組海馬區(qū)病理切片（免疫組化染色，×400）

圖4 對照組海馬區(qū)病理切片（免疫組化染色，×400）

由圖1-4可見，兩組大鼠顳葉、海馬區(qū)均可見著淡黃色或棕褐色的Pgp表達(dá)，以血管內(nèi)皮部位多見。

2.2 兩組大鼠顳葉、海馬區(qū)MDR1 mRNA表達(dá)拷貝數(shù)比較 見表2。

表2 兩組大鼠顳葉、海馬區(qū)MDR1 mRNA表達(dá)拷貝數(shù)比較

由表2可見，觀察組顳葉、海馬區(qū)MDR1 mRNA表達(dá)拷貝數(shù)高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3 觀察組顳葉、海馬區(qū)MDR1 mRNA表達(dá)水平與Pgp表達(dá)水平的相關(guān)性分析 見圖5。

圖5 觀察組顳葉、海馬區(qū)MDR1mRNA表達(dá)水平與Pgp表達(dá)水平散點(diǎn)圖

由圖5可見，觀察組顳葉、海馬區(qū)MDR1 mRNA表達(dá)水平與Pgp表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.55，P＜0.05）。

3 討論

癲癇的耐藥現(xiàn)象越來越受到關(guān)注，盡管新的藥物不斷問世，新的治療手段如外科手術(shù)、生酮飲食等越來越多地應(yīng)用于臨床，但仍有20%～30%的患者癲癇發(fā)作難以控制。因此，探索AEDs耐藥機(jī)制一直是研究者的方向。KA的化學(xué)結(jié)構(gòu)和谷氨酸類似，可引起神經(jīng)元興奮性損傷導(dǎo)致癲癇發(fā)作。其誘發(fā)的癲癇模型，病灶主要累及顳葉、海馬區(qū)，并且可出現(xiàn)反復(fù)自發(fā)性的癲癇發(fā)作，對苯妥英鈉、卡馬西平和丙戊酸鈉等一線AEDs耐藥，因此KA誘發(fā)的大鼠RE模型是研究人類RE的理想模型[3]。

近年來，多藥外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在組織中的表達(dá)及耐藥作用受到重視[5]，在各種腫瘤組織中，發(fā)現(xiàn)有瘤細(xì)胞MDR1 mRNA、Pgp高表達(dá)，導(dǎo)致對化療藥物不敏感[6-7]。在癲癇耐藥機(jī)制中，臨床推測MDR1 mRNA、Pgp也存在高表達(dá)。本研究采用KA制作RE模型，探索MDR1 mRNA及其表達(dá)產(chǎn)物Pgp的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)在顳葉、海馬區(qū)均有Pgp的高表達(dá)，而且以毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞多見，同時MDR1 mRNA表達(dá)水平與Pgp表達(dá)水平呈正相關(guān)。Zhang等[8]用人 MDR1 mRNA轉(zhuǎn)染的極化細(xì)胞系，進(jìn)行AEDs雙向轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)和濃度平衡轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)，也認(rèn)為血腦屏障中高表達(dá)的Pgp可能是使癲癇耐藥的一種新機(jī)制，而且這些AEDs轉(zhuǎn)運(yùn)效果被 Pgp抑制劑維拉帕米所阻斷。也有研究發(fā)現(xiàn)大鼠離體腦組織的毛細(xì)血管暴露于谷氨酸鹽后，其Pgp表達(dá)水平處于上調(diào)狀態(tài)，進(jìn)一步在癲癇動物模型體內(nèi)觀察到這種現(xiàn)象[9]。癲癇反復(fù)發(fā)作或慢性癲癇使血腦屏障遭到破環(huán)，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞Pgp表達(dá)水平有增多趨勢，這對RE也起到惡性循環(huán)作用[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組大鼠癲癇發(fā)生1個月后顳葉、海馬區(qū)組織仍較對照組MDR1 mRNA、Pgp表達(dá)水平高，也間接說明頻繁發(fā)作與血腦屏障破環(huán)、基因表達(dá)異常有關(guān)聯(lián)，今后可進(jìn)一步觀察不同癲癇發(fā)作頻率以及發(fā)病時間對基因、蛋白表達(dá)的影響。Stasioek等[11]分析了外周血MDR1基因C3435T多態(tài)性與兒童RE發(fā)病率之間的關(guān)系，觀察到RE的發(fā)病率與C等位基因有關(guān)，其可能會增加RE的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。Sisodiya等[12]進(jìn)一步分析了具有難治性病因（神經(jīng)上皮腫瘤、局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良和海馬硬化）的癲癇患者，發(fā)現(xiàn)手術(shù)切除標(biāo)本有MDR1 mRNA的高表達(dá)，從而反映RE的耐藥性。與普通癲癇患者比較，RE患者外周血MDR1 mRNA、Pgp表達(dá)水平顯著升高，但經(jīng)過第三代有效的AEDs艾司利卡西平治療后，其外周血MDR1 mRNA、Pgp的表達(dá)水平顯著降低，也提示RE患者的耐藥性可能與MDR1 mRNA、Pgp的高表達(dá)有關(guān)[13]。

大鼠顳葉、海馬區(qū)組織MDR1 mRNA、Pgp的高表達(dá)現(xiàn)象被證實(shí)，原因可能是多方面的，主要包括腦組織缺血缺氧、氧化應(yīng)急反應(yīng)等。MDR1 mRNA、Pgp的表達(dá)受多種信號通路調(diào)控，包括TNF-α/蛋白激酶C-β/鞘氨醇-1-磷酸受體1、血管內(nèi)皮生長因子/Src激酶等[14-15]。Pgp抑制劑可增強(qiáng)腦組織中AEDs的濃度和提高療效，但由于該類藥物存在不良反應(yīng)和缺乏組織特異性，臨床使用存在一定的局限與困難。需進(jìn)一步探討有效調(diào)節(jié)Pgp內(nèi)源性分子表達(dá)的方法，以改進(jìn)治療RE的策略。為了研究RE患者治療的新方法，未來可在癲癇患者中使用生物標(biāo)記 AEDs的方法進(jìn)行體內(nèi)成像研究，幫助發(fā)現(xiàn)相關(guān)新的研究方法[16]。