單鏈抗體融合蛋白抗腫瘤的研究進展

薛麗娜 張艾立 樓曉昆 閻輝 謝恬 劉臻

歸因于單鏈抗體（single chain Fv,ScFv）的小分子量、高穿透力和低免疫原性等優點，ScFv融合蛋白（fusion protein,FP）在腫瘤免疫治療領域具有良好的應用潛力。ScFv與不同的基因或基因片段通過基因重組融合技術制備得到FP，其具有不同功能蛋白的活性，以直接、特異性靶向和增強免疫系統的方式殺傷腫瘤細胞。本文對近年來ScFv-FP抗腫瘤的研究進展作一綜述。

1 ScFv-FP的結構與功能

靶向抗腫瘤藥物（targeted anti-tumor drugs,TAT）是將抗腫瘤藥物直接與配體相結合，在配體的靶向作用下將藥物運輸至腫瘤部位進行精準治療。在這些靶向配體中，單克隆抗體（monoclonal antibody,mAb）因其特異度高而備受關注[1]。ScFv是將抗體的輕鏈可變區（variable region of light chain,VL）和重鏈可變區（variable region of heavy chain,VH），通過一段 15～20個甘氨酸、絲氨酸或蘇氨酸的柔性肽連接成一種不含Fc片段的小分子基因抗體，其分子質量僅為原來抗體質量的1/6，但仍擁有與相應抗原結合的活性（圖1）[2]。雖然mAb在藥物代謝上更有優勢，但是ScFv與原mAb相比分子量小，翻譯后修飾較少，因此保留了與親代抗體對抗原的特異親和力。此外，ScFv更易于與FP相結合，組織穿透作用強，免疫原性低[3]。

圖1 ScFv的組裝過程

FP是指運用基因工程的方法，選擇性把兩段或多段編碼功能蛋白基因連接在一起，進而表達的新型蛋白產物。目前研究較為熱門的FP包括：（1）可影響骨髓分化的矮小相關轉錄因子（runt-related transcription factor 1,RUNX1）-蛋白酪氨酸激酶（janus kinase 2,JAK2）FP，有望用于白血病治療[4]；（2）人血清白蛋白（human serum albumin,HSA）-細胞因子FP：可用于延緩骨髓抑制性化療乳腺癌患者的中性粒細胞減少時間；（3）白介素 2（interleukin 2,rIL-2）-HSA-FP改善了rIL-2的代謝過快，加強了抗腫瘤療效；（4）人β 防御素 2（human β-defensin-2,DF）-HSA FP 在突變的胰腺細胞中攝取量更多，對腫瘤細胞的殺傷率也更大[5]；（5）延長血清半衰期的 ScFv-HSA-FP[5]；（6）人類白細胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）-綠膿桿菌（pseudomonas aeruginosa,PA）FP HlaH35A-PA0833改善了宿主對HLA的攝取與免疫器官對HLA的傳遞，增強了人體對致病菌的免疫力[6]。

ScFv-FP是一種由ScFv與蛋白融合而成，既可保持抗原抗體結合的穩定性，又可保持外部蛋白質生物活性功能的蛋白質。表1列舉了一些常見的ScFv-FP及其功能作用[7-10]。

表1 常見ScFv-FP及其功能作用

2 ScFv-FP的構建與選擇

2.1 ScFv的構建 首先從雜交瘤細胞中提取出mRNA逆轉錄得到cDNA，通過PCR擴增重鏈輕鏈的可變區基因,用連接肽將VH的C或N端與VL的C或N端相連后即可構建制得ScFv。Zhang等[11]從豬外周血淋巴細胞（peripheral blood lymphocytes，PBL）中提取RNA，并將其作為模板合成cDNA，經過PCR擴增VL與VH，通過重疊延伸PCR技術（gene splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR） 將 VH、VL和連接肽連接在一起形成全長ScFv。隨著現代分子技術的發展，目前通過噬菌體呈現技術來進行篩選可獲得ScFv。噬菌體展示技術是將所需的蛋白DNA序列插入至噬菌體的外殼蛋白基因之中，當噬菌體進行復制時，目的基因也會進行轉錄翻譯，從而得到目的蛋白，再進行蛋白篩選[12]。篩選的方式有固相、液相兩種。固相篩選中，由于得到的蛋白具有特異性，可以與肽庫上的特異性靶分子結合進行孵育，表達蛋白的噬菌體吸附于固相肽庫上，洗滌后即可除去未吸附的噬菌體。將吸附的噬菌體剝離，對宿主菌進行擴增，這一過程可使抗體含量大大增加。Xu等[13]為了更好保持抗原的天然構象也有用生物素標記抗原，用鏈親和素磁珠在磁場中通過液相分離得到ScFv，通過4輪ScFv-phage肽庫的篩選，得到富集的抗PCSK9-ScFv抗體,但這種方法也存在著每次篩選后肽庫不對稱擴增等問題。Chang等[14]開發了熒光免疫分析組成的高通量單克隆篩查系統以及使用微芯片激光驅動的克隆DNA檢索系統，這些系統能夠減少篩選次數，甚至消除復雜性較低肽庫的影響。

2.2 ScFv-FP的選擇性構建 為了得到ScFv融合基因，首先需要將目的基因和ScFv基因通過PCR相連接，然后將合成的的核苷酸序列克隆到質粒中形成重組質粒。之后將重組質粒轉化感受態大腸桿菌，離心超聲破碎后即可得到所需的FP（圖2）。如要驗證蛋白，可挑取培養后的菌落，提取質粒，進行瓊脂糖凝膠電泳分析所得的蛋白。Liu等[15]通過PCR合成抗流感PB2-ScFv抗體基因，然后將融合的ScFv結構克隆至pET-23a-T質粒中，將質粒轉化為DE3菌株，離心超聲破碎得到FP。Li等[16]直接將優化的ScFv-RB4蛋白的氨基酸序列經過雙酶（T4-DNA連接酶,Taq-DNA聚合酶）消化插入表達載體proEM，proEM使DH5α感受態的大腸桿菌轉化，得到ScFv-RBP4-FP。劉大斌等[17]分別構建了由ScFv-sTF表達的質粒pQE80LScFv-sTF和由ScFv表達的質粒pQE80L-ScFv來證明FP的抗腫瘤效果，研究結果表明ScFv-sTF可以與抗原特異性結合，對腫瘤細胞的增殖產生影響。吳黎黎等[18]構建了pFast-Bac1-scFv-IgG1Fc用于治療腺疾病，其構建的FP具有較高的抗原親和力，腫瘤殺傷能力較前明顯提升。高瑞娟等[19]通過重組質粒構建Fv-LDP-AE研究力達霉素（lidamycin,LDM）FP對腫瘤侵襲的影響，其中LDM是由一個酸性輔基蛋白（lida-protein,LDP）和一個烯二炔發色團（active enediyne,AE）組成。實驗結果表明其構建的Fv-LDP-AE對人肝癌細胞的生長和轉移具有抵抗抑制作用。

圖2 ScFv-FP的構建過程

3 ScFv-FP的表達

ScFv-FP的獲得還需通過外界載體的表達，目前比較常用的表達體系有大腸桿菌表達體系、酵母表達體系、昆蟲表達體系、哺乳動物表達體系等等，而目前穩定且熱門的主要是大腸桿菌和酵母表達系統。

3.1 大腸桿菌表達系統 大腸桿菌用于抗體的表達歷史悠久，目前大部分的抗體或抗體片段均通過大腸桿菌這個體系表達。大腸桿菌細胞膜與外膜有著周漿間隙，根據其蛋白去路可分為胞外分泌、胞質表達、周質表達3種：（1）胞外分泌主要分泌少數小分子肽；（2）胞質表達分泌的蛋白表達量最多，但一般均為無活性包涵體；（3）周質表達的位置位于外膜與細胞膜之間，自身活性受外界因素影響較大。大腸桿菌產量高、生長速度快，能選擇性吞噬質粒，是外源性蛋白表達的主要途徑。由于抗體含有二硫鍵和多個順式脯氨酸多肽構型，在大腸桿菌表達過程中會導致蛋白質水解或錯誤折疊，從而可能產生毒性蛋白[20]。另外，原核生物中缺乏糖基化和磷酸化功能，使得外源性的蛋白表達過程存在一定的弊端。為了解決上述問題，提高大腸桿菌的表達量和表達效率，近年來通過優化mRNA模板、使用融合標簽、降低包涵體形成技術、自誘導技術、高細胞密度培養技術、流加培養技術等可大幅提高外源性蛋白的表達含量與準確率[21]。

3.2 酵母表達 酵母菌是最常見的簡單真核生物，繁殖快，實驗操作簡單，還有真核生物對外源蛋白加工修飾等功能。用于蛋白翻譯的酵母主要有酒釀酵母、多形漢森酵母、巴斯德畢赤酵母、溶脂亞羅菌、乳克魯維酵母等，其中應用最廣泛的為巴斯德畢赤酵母[22]。與原核生物相比，巴斯德畢赤酵母中的甲醇代謝啟動子AOX1可翻譯大量蛋白，分泌效率高、穩定性好，與動植物昆蟲等表達載體在操作上更簡單，成本更低[23-24]。其次巴斯德畢赤酵母表達的抗體與PBL分泌的抗體相似性較高，具有較強的抗腫瘤能力。但酵母中N-糖基化、O-糖基化修飾與人源糖基化顯著不同，其可導致免疫原性增加，得到的蛋白半衰期變短等一系列問題。通過酵母分泌途徑中準確引入人源糖基酶和糖基轉移酶可產生人類使用的白蛋白，從而提高蛋白表達的效率。因此使用酵母進行ScFv-FP表達也具有較大的市場價值。

4 ScFv-FP抗腫瘤的機制

ScFv-FP的抗腫瘤機制主要取決于其FP性質對應的抗腫瘤生物活性，以下列舉部分FP的抗腫瘤機制。

4.1 阻滯腫瘤細胞周期 高瑞娟等[25]構建了由抗明膠酶 ScFv（3G11）和 LDM 組成的 Fv-LDP-AE，體外實驗表明Fv-LDP-AE通過LDM誘導腫瘤細胞周期阻滯和凋亡，0.01 nmol/L Fv-LDP-AE就能夠阻滯細胞周期S期和G2/M 期。盛唯瑾等[26]研究表明，ScFVLDM-FP能降低人乳腺癌MCF-7細胞中表皮生長因子（epidemal growth factor receptor,EGFR）mRNA的表達，通過抑制Ras和ERK1/2蛋白的表達，阻滯細胞G2/M期。鐘根深等[27]研究中構建的ScFv-FP（dFv-LDP-AE）可增強LDP抑制膠原蛋白酶的作用，使HCC在G2/M期發生阻滯。

4.2 靶向殺傷腫瘤細胞 Kanagawa等[28]研究表明，ScFv-CTL可以特異性結合VEGFR2/flk1靶向殺傷腫瘤細胞。倪長偉等[7]構建的ScFv-sTRAIL可以與腫瘤細胞特有的表面抗原靶向結合并激活TRAIL-2，增強了其腫瘤治療的靶向性與殺傷性。鐘根深等[27]將LDM、抗明膠酶dFv-LDP和強化ScFv-FP（dFv-LDPAE），分別作用于高表達明膠酶的人纖維肉瘤HT-1080。研究結果表明LDM、抗明膠酶dFv-LDP和強化ScFv-FP（dFv-LDP-AE）均對腫瘤細胞有抑制和殺傷能力，與常用來治療纖維肉瘤的氨甲喋呤（methotrexate,MTX）比較，dFv-LDP-AE對腫瘤細胞的的殺傷能力顯著高于MTX，其半數抑制濃度（IC50）低于MTX 1 000倍或更多。

4.3 抑制腫瘤細胞的增殖 談燚等[8]成功地構建了整合PD-L1抗體的ScFv-mFc，注射了5 mg/kg劑量ScFv-mFc的荷瘤小鼠瘤體體積平均增長率從14.90%降低至3.72%，體內實驗顯示ScFv-mFc對腫瘤的抑制生長作用。孫蕊等[29]設計了針對CD20且富含顯性T細胞表位的ScFv-pLLO，作用于B細胞淋巴瘤細胞系Raji和T淋巴細胞系Jurkat E6-1，實驗結果表明ScFv-pLLO能有效抑制RaJi細胞生長，并且對Jurkat E6-1細胞不產生作用。

4.4 誘導細胞發生凋亡 郭曉芳等[30]通過實驗發現不同濃度LDP-Hr-AE均能誘導腫瘤細胞凋亡，LDPHr-AE濃度越高，細胞凋亡率越高。孫蕊等[29]以抗CD20的ScFv與顯性表位結合得到ScFv-pLLO，ScFv的作用機制主要為抗體依賴細胞介導的細胞毒作用（antibodied depend on cell-mediated cytotoxicity,ADCC）、補體依賴細胞介導的細胞毒作用（complement depend on cell-mediated cytotoxicity,CDC）和細胞程序性死亡（programmed cell death,PCD）。ScFv抗CD20抗體中的二型誘導凋亡作用較強，但缺少Fc片段使得ADCC和CDC作用下降，因此加入顯性抗原肽LLO來提高其抗瘤細胞活性。實驗結果表明ScFv-pLLO可顯著提高瘤細胞的凋亡率，加入ScFv-pLLO的RaJi細胞凋亡率分別是空白組和無關對照組的6.7倍和5.9倍。

4.5 抑制腫瘤細胞遷移 高瑞娟等[25]研究表明，Fv-LDP-AE是一種基于3G11對腫瘤細胞Ⅳ型膠原酶靶向結合特性而構建的增強型FP。BoydenChamber侵襲實驗表明Fv-LDP-AE能抑制BEL-7402細胞侵襲。封云等[31]通過Fab-LDM對人纖維瘤細胞作用發現ScFv-FP對腫瘤細胞遷徙的抑制作用最強。

4.6 增強機體免疫應答 杜志娜等[32]研究結果表明，西妥昔單抗-MICB（major histocompatibility complex-I-related chain molecules B）FP可以加強自然殺傷細胞免疫抑制腫瘤細胞Huh7的增殖。Wu等[33]驗證霍亂霉素b亞基（cholera toxin B subunit,CTB）/生長激素抑制素（somatostatin,SS）可以誘導體內CTB和SS的特異性免疫，讓患者血清生長激素恢復正常水平。王璇等[34]構建的細胞因子 FP（IP10-EGFRvⅢ-ScFv）可以增強體內淋巴細胞免疫功能，并穿過血腦屏障殺傷腫瘤細胞，同時免疫記憶能有效避免腫瘤復發。

5 ScFv-FP的應用

5.1 腫瘤靶向治療 ScFv具有分子質量小、穿透力較強、特異性較高、免疫原性低、不良反應較小等優點，可將脂質體、藥物、免疫毒素、病毒載體等與ScFv連接，形成免疫藥物或者免疫毒素等，同時利用抗原與抗體特異性結合的特點，特異性免疫殺傷腫瘤細胞。ScFv-FP抗腫瘤藥物由于靶向治療針對性強，療效顯著，在殺傷腫瘤細胞時基本不損傷正常組織，已在臨床腫瘤治療中得到應用。Makvandi-Nejad等[35]構建的ScFv-CTL可特異性結合血管內皮生長因子受體2，靶向殺傷腫瘤細胞。

5.2 細胞免疫 病毒感染生物體后，細胞內表達能識別某種病毒編碼蛋白的抗體，從而阻止病毒在細胞間傳遞。ScFv-FP能在細胞內克隆與表達，從而可用于病毒感染性疾病的診斷和治療。ScFv-FP在細胞內免疫應用主要有兩種表型敲除：（1）細胞內表達特定抗體分子，阻斷特定內源蛋白活性，用于靶蛋白的生物學功能基因治療；（2）通過細胞內抗體對特定功能蛋白進行干擾，以達到治療目的。

5.3 影像診斷 由于ScFv具有很強的穿透能力，其在腫瘤組織中的分布指數高于完整抗體分子，可使腫瘤定位圖像明確、清晰，同時可使放射性核素消除迅速,避免非特異性損傷，因而對人體危害小，可用于影像學腫瘤成像和定位診斷。IFN-γ與Ⅰ標記ScFv聯合應用可使局部腫瘤標志物濃度提高2～4倍，可顯著增強顯像效果[36]。放射性同位素標記的ScFv在進行腫瘤影像學分析時，將針對腫瘤特異性抗原或相關抗原的標記抗體注入體內，確定腫瘤位置，再通過內照射效應達到放射性免疫治療。

5.4 生物檢測 ScFv易于制備，親和力良好，常用以快速、準確檢測食物和水等中的有害物質。Makvandi-Nejad等[35]制備的抗莫能菌素ScFv，可靈敏高效檢測出莫能毒素。Meyer等[37]構建的抗沙門桿菌外膜蛋白ScFv，能快速準確檢測出是否存在沙門桿菌感染。

6 總結與展望

ScFv-FP作為一種小分子基因工程抗體，在理論和應用方面的研究頗有進展，在抗腫瘤、構建其他工程抗體、顯像定位診斷、靶向治療和細胞內免疫以及生物檢測等方面展現出了廣闊的應用前景。同時，ScFv-FP藥物市場也持續擴容，2004年羅氏上市的VEGFR單抗Avastin適用于聯合以5-FU為基礎的化療方案一線治療轉移性結直腸癌，2012年美國食品藥品監督管理局（U.S.Food and Drug Administration,FDA）和歐洲藥品管理局先后批準了Zaltrap通過靜脈給藥治療轉移性結直腸癌的方案，2014年FDA批準PD-1抗體Opdivo和Keytruda可用于治療惡性黑色素瘤、轉移性鱗狀非小細胞肺癌、腎細胞癌和肝細胞癌，2015年FDA先后批準單抗藥物Darzalex和Empliciti適用于治療復發和難治多發性骨髓瘤成人患者。盡管應用市場不斷擴大，但目前研究仍然存在許多問題，如基于ScFv的小分子量，其在體內清除速率過快，甚至可能無法達到有效的診斷和治療周期；其次，其穩定性也較差，受到自身結構、配方、環境及生產操作等多種因素影響，需對其進行有效評估并進行改造。