高效液相色譜串聯質譜法測定葡萄中精甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑及其代謝物CCIM殘留

黃 鑫，賈福艷，劉良月，關 鑫，楊沛文，郭紅霞，張 雙，楊雪葳，黃成田*

(1.沈陽沈化院測試技術有限公司，遼寧 沈陽 110021；2.沈陽化工研究院有限公司，遼寧 沈陽 110021)

1 前言

精甲霜靈，又名為高效甲霜靈，對瓜果、蔬菜上的疫病、霜病毒，煙草黑脛病、辣椒霜霉病等病害防治效果明顯[1-4]。現階段，對精甲霜靈殘留量的報道主要集中于煙葉、番茄、馬鈴薯、人參、葡萄、黃瓜等[5-8]，分析方法多為液相色譜法和氣相色譜法，未見精甲霜靈在液相色譜串聯質譜上的分析報道。我國GB2763-2021規定精甲霜靈的殘留物定義為甲霜靈。

吡唑醚菌酯，又名唑菌胺酯，是具有殺菌譜廣、活性高、持效期長、毒性低、對非靶標生物安全的殺菌劑[9]，對于真菌性病害如銹病、葉枯病、霜霉病、白粉病等有很好的防治效果，其作用機理是干擾細胞間能量的供給，造成細胞中能量不足，進而起到殺菌的作用[10]。

氰霜唑，化學名稱為4-氯-2-氰基-N，N-二甲基-5-對甲苯基咪唑-1-磺酰胺，對霜霉病、疫病如黃瓜霜霉病、葡萄霜霉病、番茄晚疫病、馬鈴薯晚疫病等有極高的抑制活性。氰霜唑在使用后會迅速分解，主要降解產物為CCIM[11]。我國GB2763-2021規定氰霜唑的殘留物定義為氰霜唑和代謝物CCIM之和。

目前，尚未見同時檢測葡萄中精甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑及其代謝物CCIM的殘留分析方法。本文建立了采用高效液相色譜-串聯質譜同時測定葡萄中精甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM的殘留分析方法，方法選擇性好，回收率高，分析時間短，適合葡萄中精甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑及其代謝物CCIM的痕量分析。

2 試驗部分

2.1 儀器和試劑 島津LC-AD高效液相色譜(日本島津公司)-質譜聯用儀(API4500QTrap，美國AB公司)；電子分析天平(0.000 1g和0.01g，賽多利斯)；回旋振蕩器HY-5(常熟國華電器有限公司)；超純水機(美國密理博公司)。

乙腈(色譜純，Fisher)；乙酸(分析純，西隴化工有限公司)；甲酸(色譜純，Fisher)；PSA(40-60μm，60?，博納艾杰爾科技有公司)；C18(50μm，60?，博納艾杰爾科技有限公司)；氯化鈉(分析純，西隴化工有限公司)。

甲霜靈標準品：純度98.5%；吡唑醚菌酯標準品：純度98.0%；氰霜唑標準品：純度99.2%；CCIM標準品：純度99.3%。

2.2 樣品前處理 稱取10.00g(±0.01g)粉碎后的空白葡萄樣品于150mL三角瓶中，加入50mL乙腈(含1%乙酸)，振蕩提取30min，再加入約6g氯化鈉，旋渦混勻約30s，靜置分層后，取2.00mL乙腈層，加入100mg PSA、50mg C18凈化，漩渦混勻約30s，過0.22μm有機濾膜，待HPLC-MS/MS檢測。

2.3 儀器分析條件

2.3.1 液相色譜條件 液相色譜柱：Waters Acquity UPLC C1850mm×2.1mm ，1.7μm；柱溫：40℃；流速0.4mL/min；進樣體積：10.0μL；流動相：0.1%甲酸水(A)和0.1%甲酸乙腈(B)。

表1 流動相梯度洗脫參數

2.3.2 質譜條件 電離源模式：電噴霧離子源；掃描方式：正離子；離子源電壓：4500V；離子源溫度：450℃；EP電壓：10V；CXP電壓：9V。

2.4 標準溶液的配制 儲備液配制：分別稱取甲霜靈標準品0.025 38g，氰霜唑標準品0.025 20g，吡唑醚菌酯標準品0.025 51g，CCIM標準品0.025 18g于25mL容量瓶中，用乙腈溶解定容至刻度線，配得濃度均為1 000mg/L儲備液，于-4℃避光保存。

標準溶液配制：分別用乙腈和葡萄空白基質配制0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05和0.1mg/L的系列混合標準工作溶液，用于考察基質效應。

2.5 添加回收率試驗 取空白葡萄樣品，加入一定量的甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑及其代謝物CCIM混合標準溶液，在0.01、0.1和1.0mg/kg 3個水平下進行添加回收試驗，每個水平設置5個重復。經2.2處理后測定，計算回收試驗的回收率和相對標準偏差。

3 結果與討論

3.1 HPLC-MS/MS條件選擇

3.1.1 質譜條件優化 分別配制質量濃度為0.1mg/L的甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM的標準溶液，首先在Q1 SCAN模式下分別進行了正離子掃描和負離子掃描，發現正離子掃描信號強度較高，因而選擇正離子掃描，確定4種化合物的母離子。然后在Product Ion Scan模式下得到高質量的MS2圖，確定化合物的子離子。最后根據前面選出的母離子、子離子，組件MRM離子對，優化CE和DP。最終優化好的質譜參數(表2)，標準溶液譜圖(圖1)。

表2 質譜參數

圖1 甲霜靈標準溶液(0.1mg/L)(a)；吡唑醚菌酯標準溶液(0.1mg/L)(b)；氰霜唑標準溶液(0.1mg/L)(c)；CCIM標準溶液(0.1mg/L)(d)

3.1.2 液相條件優化 本試驗選擇Waters Acquity UPLC C1850mm×2.1mm，1.7μm和Agilent Extend C1850mm×4.6mm，3.5μm兩種色譜柱進行峰型和響應比較，發現1.7μm優于3.5μm。

分別選擇乙腈：水、乙腈：0.1%甲酸水、0.1%甲酸乙腈：0.1%甲酸水3種不同的流動相進行梯度洗脫，發現乙腈：水作為流動相時CCIM有拖尾的現象，乙腈：0.1%甲酸水、0.1%甲酸乙腈：0.1%甲酸水作為流動相時4種化合物峰型較好，且0.1%甲酸乙腈：0.1%甲酸水作為流動相時4種化合物均獲得較高的響應，因此選擇0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈作為流動相進行梯度洗脫。

3.2 前處理條件選擇 通常根據化合物的理化性質和樣品成分來選擇提取溶劑。依據相似相溶原理，本試驗先選擇了乙腈作為提取溶劑，發現CCIM的回收率偏低，不能滿足回收率要求。然后選擇甲醇進行提取，4種農藥回收率均能滿足要求，但葡萄樣品糖分含量較高，雜質較多，甲醇提取范圍較大，提取出的提取液雜質也較多。而向乙腈提取液中加入乙酸后，4種農藥的回收率均能滿足要求，且提取液較干凈，因此最后選擇1%乙酸乙腈作為提取溶劑。

3.3 基質影響評價 分別用乙腈、空白葡萄提取液配制甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM的系列混合標準溶液，按照先后順序進行檢測，并分別制作標準曲線，通過比較斜率的偏差，評價基質的影響，結果(表3)。甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM在葡萄中的基質效應均為弱基質效應。因此我們在檢測葡萄中甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM時，可選擇乙腈配制系列工作溶液。

表3 葡萄中甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM的基質效應

3.4 方法的線性、回收率、精密度 分別以甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM的質量濃度為橫坐標(x)，以對應的峰面積為縱坐標(y)作圖，結果表明，甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM在0.001～0.1mg/L范圍內線性良好，相關系數r均>0.99。

4種農藥在葡萄基質中分別進行3個水平的添加回收率實驗，每個處理重復5次。采用外標法定量，甲霜靈在葡萄中的平均回收率為84%～86%，RSD為1.3%～3.8%，吡唑醚菌酯在葡萄中的平均回收率為89%～92%，RSD為2.2%～3.8%，氰霜唑在葡萄中的平均回收率為87%～89%，RSD為5.2%～6.7%，CCIM在葡萄中的平均回收率為83%～91%，RSD為3.8%～5.4%，甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM在葡萄中殘留檢測方法的定量限(LOQ)均為0.01mg/kg，符合農藥殘留分析方法要求[12]。

表4 葡萄中添加回收試驗(n=5)

4 結論

本文建立了一種能夠同時簡便、快速、準確檢測葡萄樣品中精甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑及其代謝物CCIM的殘留分析方法。該方法前處理簡單、分析時間短、儀器選擇性高，滿足樣品殘留分析的要求，適用于葡萄中精甲霜靈、吡唑醚菌酯、氰霜唑及其代謝物CCIM的殘留檢測。