miR-26b在ob/ob小鼠組織中的表達研究*

范智勇，薛 永，趙亞萍，徐廣峰

江蘇省淮安市第三人民醫院檢驗科，江蘇淮安 223001

世界范圍內，肥胖已經演變成為不可忽視的公共衛生問題。而近年來，microRNA(miRNA)在肥胖癥的發生、發展過程中的作用受到廣泛關注。研究表明，miRNA-26b(miR-26b)在腫瘤的發生、發展過程中發揮重要作用[1]。而既往有研究顯示，miR-26b在脂肪細胞分化過程中上調，在成熟脂肪細胞中高表達，其在脂肪細胞分化過程中發揮重要的調節作用[2]。瘦素基因遺傳性缺陷ob/ob小鼠是常用的研究肥胖的動物模型，它是瘦素基因純合突變的小鼠，特征為肥胖、多食、高血糖和胰島素抵抗。本研究通過觀察miR-26b在ob/ob小鼠心臟、肝臟、胰、脾、肺、腎臟、骨骼肌、小腸及脂肪組織中的表達變化，以及檢測瘦素干預小鼠成熟脂肪細胞后miR-26b的表達變化，探討miR-26b在肥胖發生、發展中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 雄性16周齡野生型C57/BL6J小鼠8只、瘦素基因遺傳性缺陷ob/ob小鼠12只，購自南京大學模式動物研究所。

1.2標本采集 動物禁食12 h后，稱體質量、測體長，以5%水合氯醛溶液腹腔內注射麻醉，小鼠仰臥位固定，剪去胸前區被毛，乙醇消毒皮膚后，將左手食指放于左側第3～4肋間觸摸到心搏處，右手持帶有4號針頭的注射器，選擇心搏最強處穿刺，收集血液至離心管，室溫放置離心管至有血清析出，離心(2 000 r/min，10 min)取上清液。右手抓住鼠尾用力向后拉，同時左手拇指與食指向下按住鼠頭，將脊髓與腦髓拉斷，脫臼處死小鼠后，乙醇消毒腹部和胸部皮膚，然后將腹腔和胸腔剪開，取心臟、肝臟、脾、胰、腎臟、肺、小腸、生殖器周圍皮下白色脂肪組織、肩胛間區棕色脂肪組織、骨骼肌適量，—80 ℃冰箱保存組織用于后續的實驗。

1.3血糖、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)檢測 將離心好的小鼠血清，分別采用葡萄糖氧化酶法、甘油磷酸氧化酶-過氧化物法、膽固醇氧化酶法在TBA-2000FR全自動生化分析儀(日本東芝)上完成血糖、TG、TC的檢測，嚴格按照相應試劑盒說明書操作。

1.4細胞培養 小鼠3T3-L1細胞株購自上海細胞生物研究所，采用脂肪前體細胞完全培養液[DMEM+10%胎牛血清(加拿大Wisent公司)]在37 ℃孵箱(5%CO2) 中培養，每兩天換液1次。待細胞生長至完全融合后2 d(第0天)開始誘導分化，培養液換用含0.5 mmol/L 1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(MIX)、1 μmol/L地塞米松和5 mg/L胰島素的完全培養液(美國Sigma公司)。48 h后換成只含5 mg/L胰島素的完全培養液，每兩天換液1次，至第 8 天，經油紅O(北京天根生物科技有限公司) 染色法鑒定，90%以上細胞分化為成熟脂肪細胞后進行后續的干預實驗。

1.5瘦素干預 在3T3-L1脂肪前體細胞誘導分化為成熟脂肪細胞后，采用磷酸鹽緩沖液(PBS，加拿大Wisent公司)清洗細胞兩次，然后用含100 ng/mL 瘦素(美國Sigma公司)的細胞培養液繼續培養16 h后，在12孔細胞培養板的每孔中加入700 μL Trizol總RNA提取試劑(美國invitrogen生命技術有限公司)收集細胞，于—80 ℃低溫冰箱(日本三洋)凍存備用。實驗均設立對照組，瘦素干預組設6個平行孔。

1.6miR-26b表達水平檢測 將含700 μL Trizol總RNA提取試劑的細胞凍存管置于室溫環境下，待融化后靜置5 min。取50 mg左右小鼠組織進行充分勻漿，加入700 μL Trizol總RNA提取試劑，室溫靜置5 min。在上述各試管中加入140 μL氯仿振蕩15 s，靜置5 min，4 ℃低溫離心機12 000×g離心15 min，取上清液，采用離心柱法抽提細胞和組織總RNA(Qiagen公司)，操作嚴格按照說明書進行。采用微量分光光度計(One Drop OD 1000)對RNA進行定量和純度分析，要求A260/A280值為1.8～2.0。采用miRNA反轉錄試劑盒(ABI公司，15 μL體系)將總RNA反轉錄成cDNA，嚴格按照說明書進行操作。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)技術檢測miR-26b水平，選擇snRU6為內參照。miR-26b和snRU6內參基因Taqman探針均購自美國Life Technology公司。應用2—ΔCT方法計算目的基因的相對表達水平。

2 結 果

2.1ob/ob小鼠及C57/BL6J小鼠糖脂代謝情況比較 ob/ob小鼠的體質量、血糖、TG及TC水平明顯高于C57/BL6J小鼠，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 C57/BL6J小鼠及ob/ob小鼠糖脂代謝情況比較

2.2C57/BL6J小鼠miR-26b表達的組織學特征 采用qRT-PCR 技術檢測C57/BL6J小鼠心臟、肝臟、胰、脾、肺、腎臟、骨骼肌、小腸及脂肪組織中miR-26b表達，發現miR-26b在C57/BL6J小鼠心臟、脂肪、胰組織中表達水平較高，而在小腸、腎臟、骨骼肌組織中表達水平較低，組織間表達差異較大，表達水平最高的是心臟組織(0.049±0.008)，最低的為腎臟組織(0.000 21±0.000 05)，兩者相差200余倍，見圖1。

注：與C57/BL6J小鼠比較，*P<0.05。

2.3ob/ob小鼠及C57/BL6J小鼠miR-26b表達的比較 ob/ob小鼠各種組織中miR-26b的表達見圖1。與C57/BL6J小鼠比較，miR-26b在ob/ob小鼠心臟、胰、白色脂肪組織中表達水平明顯下降(P<0.05)，在肺、骨骼肌、腎臟及小腸組織中表達水平明顯升高(P<0.05)；而兩種小鼠miR-26b在肝臟、脾、棕色脂肪組織中表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4瘦素對小鼠成熟脂肪細胞 miR-26b表達的影響 將3T3-L1脂肪前體細胞(圖2A)誘導分化為成熟脂肪細胞(圖2B)， 100 ng/mL瘦素干預16 h后，采用qRT-PCR技術檢測脂肪細胞中miR-26b表達水平，結果發現瘦素可明顯下調脂肪細胞miR-26b表達水平(圖2C)。

注：A為脂肪前體細胞油紅O染色圖；B為成熟脂肪細胞油紅O染色圖；C為瘦素干預小鼠成熟脂肪細胞0 h及16 h后miR-26b表達水平；與對照組比較，*P<0.05。

3 討 論

肥胖已逐漸演變成全球性的公共衛生問題，世界衛生組織的數據顯示，1975年以來，世界肥胖人數已增長近3倍，截至2016年，18歲及以上的成年人中逾19億人超重，其中超過6.5億人肥胖，超過3.4億例5～19歲的兒童和青少年超重或肥胖；截至2019年，3 800萬例5歲以下兒童及嬰幼兒超重或肥胖[3]。而我國的情況更加嚴重，2015年《中國居民營養與慢性病狀況報告》顯示，截至2012年我國18歲及以上成人超重率為30.1%，肥胖率為11.9%，6～17歲兒童和青少年超重率為9.6%，肥胖率為 6.4%。最近的一項研究表明，我國18歲以上的居民中，有29.1%(2.778億)為中心性肥胖(腹部肥胖)，其中男性約為1.40億，女性約為1.38億，而腹部肥胖與代謝綜合征密切相關[4]。肥胖是遺傳、環境和生活方式相互作用的結果，肥胖無論采用保守療法還是外科手術治療效果均不理想，這可能與肥胖相關的代謝紊亂有關。因此，闡明肥胖的發生機制，尋找有效的肥胖防治方法已迫在眉睫。

miRNA是真核生物體內一類長度約為22個核苷酸(nt)的內源性非編碼單鏈小RNA，其主要通過作用于靶基因的3′非翻譯區(3′-UTR)轉錄后水平調控基因的表達[5]，miRNA幾乎參與調節一切生命活動和大多數疾病過程[6]。近年來miRNA在肥胖及其相關并發癥發病過程中的作用受到廣泛關注。多項研究表明，脂肪組織分泌的外泌體miRNA可能在肥胖導致的脂肪肝方面發揮作用，另外，肥胖可導致脂肪因子和肥胖相關的miRNA失調，而脂肪因子和miRNA的相互調節作用在肥胖及其相關疾病的發生、發展過程中亦發揮調控作用[7-8]。早期研究表明肥胖與胰島素抵抗、2型糖尿病密切相關，但有研究也提示肥胖與Ⅰ型糖尿病關系十分密切[9]。miRNA的表達往往呈現明顯的組織特異性，并可影響其在特定組織中的調節功能。本研究結果表明miR-26b在C57/BL6J小鼠心臟、脂肪、胰等組織中表達水平較高。SONG等[10]發現miR-26b隨著脂肪前體細胞的誘導分化，表達水平逐漸升高，而在脂肪前體細胞中敲低miR-26b可明顯抑制其分化為成熟脂肪細胞。XU等[11]發現miR-26b過表達對人成熟脂肪細胞胰島素敏感性具有促進作用。有研究報道，miR-26b通過靶向作用于PTEN基因促進3T3-L1脂肪細胞的分化[12]。由此可見，miR-26b可能是一條與機體代謝功能密切相關的miRNA。

ob/ob小鼠由于瘦素基因突變致其表達產物瘦素活性喪失，發生自發性肥胖，其發病過程與人類肥胖相似，因此成為研究人類肥胖最常用的動物模型之一。本研究中，16周齡的ob/ob小鼠體質量為野生型C57/BL6J小鼠的2倍多，并出現高血糖、高血脂，呈現明顯的肥胖表型并伴有代謝紊亂。與C57/BL6J小鼠比較，ob/ob小鼠心臟、胰、白色脂肪組織中miR-26b表達水平明顯下降(P<0.05)，肺、骨骼肌、腎臟及小腸組織中miR-26b表達水平明顯升高(P<0.05)，而在肝臟、脾、棕色脂肪組織中的表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。ob/ob小鼠miR-26b表達變化呈現不同的組織學特征，提示肥胖機體miR-26b表達調控機制復雜，其在不同組織中發揮的生物學作用是否存在差異尚待進一步探討。

3T3-L1細胞在體外誘導后能特異性地分化為成熟脂肪細胞，被廣泛應用于脂肪細胞特性和功能的研究。鑒于ob/ob小鼠瘦素功能缺失，而3T3-L1脂肪細胞中miR-26b的表達調控研究鮮有報道，本研究采用瘦素干預3T3-L1成熟脂肪細胞，觀察miR-26b表達的變化，結果發現瘦素可明顯下調miR-26b表達水平，提示瘦素功能缺失并非ob/ob小鼠白色脂肪組織中miR-26b表達下調的直接原因。研究表明，炎癥因子、激素、游離脂肪酸等對人脂肪細胞中的miR-26b表達均具有調控作用，腫瘤壞死因子(TNF)-α、游離脂肪酸、地塞米松可下調人脂肪細胞中miR-26b表達水平，而生長激素可促進人脂肪細胞中miR-26b表達[13-14]。ob/ob小鼠脂肪代謝嚴重失調，同時伴有慢性炎癥，血清游離脂肪酸及TNF-α等炎癥因子水平明顯升高[15]，這些因子可能與其白色脂肪組織、心臟、胰中miR-26b表達水平下降有關。

miRNA生物學作用大，表達調控復雜。進一步分析本研究結果發現，miR-26b在C57/BL6J小鼠骨骼肌中表達水平極低，為白色脂肪組織的1/10，但在ob/ob小鼠骨骼肌中表達水平升高極為明顯，為白色脂肪組織的8倍之多。骨骼肌、脂肪組織同為胰島素作用的靶器官，但miR-26b的表達變化模式卻截然相反，其原因尚不清楚。白色脂肪組織是TG的貯存場所，miR-26b在白色脂肪組織中發揮促進葡萄糖攝取、TG合成的作用，其在骨骼肌中的作用有待進一步闡明。