不同滅活方式對攜帶新型冠狀病毒的物體表面標本核酸檢測結果的影響

徐建男

江蘇省蘇州市吳中區(qū)疾病預防控制中心檢驗科,江蘇蘇州 215128

2020年2月11日，國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布了關于修訂新型冠狀病毒肺炎英文命名事宜的通知，決定將“新型冠狀病毒肺炎”英文名稱修訂為“COVID-19”，同時，國際病毒分類委員會聲明將新型冠狀病毒命名為“SARS-CoV-2”。目前，國家衛(wèi)生健康委員會推薦的病原學檢查方法是實時熒光定量PCR(RT-PCR)和新一代測序(NGS)方法，由于NGS方法存在價格昂貴、人員要求高等局限性，基層醫(yī)療機構和疾病預防控制機構仍然是以RT-PCR檢測為主[1-2]。中華醫(yī)學會檢驗醫(yī)學分會發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎病毒核酸檢測專家共識》指出，需將待測標本56 ℃ 孵育至少45 min或更高溫度進行滅活[3]。LECLERCQ等[4]對中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-Cov)的研究表明其在56 ℃ 孵育25 min，病毒滴度會降低10-4，進一步升高溫度到65 ℃處理15 min沒有任何殘留。RABENAU等[5]也發(fā)現(xiàn)SARS冠狀病毒(SARS-CoV)在56 ℃孵育30 min后，滴度低于檢測限，溫度升高到60 ℃ 30 min，SARS-CoV完全被滅活。物體上攜帶的新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)也可以傳染給人類，所以各級檢測機構開展了對物體表面攜帶SARS-CoV-2的檢測。為了明確SARS-CoV-2滅活后是否對核酸檢測有影響，本研究將對滅活前和不同滅活處理方式(56 ℃ 45 min、60 ℃ 30 min、75%乙醇30 min處理)滅活后平均循環(huán)閾值(Ct值)進行比較分析。

1 材料與方法

1.1標本來源 選擇區(qū)級檢測機構送檢的物體表面標本25份，經(jīng)過RT-PCR檢測結果均為陽性，其中14份(標本號1～14)標本為蘇州市相城區(qū)疾病預防控制中心篩選送檢的陽性標本，11份(標本號15～25)標本為蘇州市工業(yè)園區(qū)疾病預防控制中心篩選送檢的陽性標本。

1.2標本處理及滅活 每份標本平均分成4份，采用DMEM培養(yǎng)液(Gibco 公司，貨號：12430-054)分別進行4種不同的處理方式：(1)未滅活組，100 μL標本+300 μL DMEM 4～8 ℃，30 min；(2)滅活組，①100 μL標本+300 μL DMEM 60 ℃，30 min；②100 μL標本+300 μL DMEM 56 ℃，45 min；③100 μL標本+300 μL 無水乙醇，形成終濃度75%的環(huán)境，4～8 ℃，30 min。

1.3核酸提取及RT-PCR檢測 采用Roche MagNA Pure 96 system全自動核酸提取儀配套的MagNa Pure 96 DNA and Viral NA Small Volume Kit 提取病毒核酸，采用達安生物科技有限公司的SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒(國械注準20203400063)，按試劑盒說明書在羅氏LightCycler 480Ⅱ PCR儀進行擴增，同時檢測ORF和N基因，陽性判讀標準參考試劑說明書。所有標本重復檢測3次，記錄Ct值。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，未滅活組和不同滅活組間標本的Ct值采用Mauchly球形度檢驗和Greenhouse-Geisser 檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1未滅活組與滅活組標本Ct值比較 不同處理方式下ORF基因 和N基因的Ct值分布，見表1。未滅活組和滅活組Ct值比較，差異有統(tǒng)計學意義(ORF基因：F=48.740，Eta=0.720，P<0.05；N基因：F=65.597，Eta=0.781，P<0.05)；滅活組60 ℃水浴30 min和56 ℃水浴45 min Ct值比較，差異無統(tǒng)計學意義(ORF基因：P=0.306；N基因：P=0.920)，60 ℃水浴30 min與75%乙醇30 min Ct值比較，差異有統(tǒng)計學意義(ORF基因：P<0.05；N基因：P<0.05)，56 ℃水浴45 min與75%乙醇30 min Ct值比較，差異有統(tǒng)計學意義(ORF基因：P<0.05；N基因：P<0.05)。

表1 未滅活組與滅活組ORF基因和N基因平均Ct值比較

續(xù)表1 未滅活組與滅活組ORF基因和N基因平均Ct值比較

2.2未滅活組和滅活組ORF基因和N基因Ct值區(qū)間變化 從圖1 和圖2中可以看出當未滅活組ORF基因Ct值為22～26時，未滅活組和滅活組Ct值比較接近，兩組ORF基因、N基因Ct值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；隨著未滅活組ORF基因Ct值的增大，未滅活組和滅活組Ct值差異逐漸加大，當未滅活組ORF基因Ct值>36時，滅活組不同處理方式下ORF基因的全部Ct值>40；而未滅活組ORF基因Ct值≥34時，75%乙醇30 min處理ORF基因Ct值>40。

圖1 未滅活組和滅活組ORF基因Ct值的區(qū)間變化

圖2 未滅活組和滅活組N基因Ct值的區(qū)間變化

3 討 論

新型冠狀病毒肺炎作為突發(fā)公共衛(wèi)生事件，其傳播速度快，感染性強，給全人類帶來了嚴重的健康威脅和經(jīng)濟負擔。核酸檢測作為目前確診新型冠狀病毒肺炎最主要的方法，靈敏度高，特異性強，在疾病早期快速診斷和動態(tài)觀察抗病毒治療效果中具有優(yōu)勢[6]。SARS-CoV-2屬于β屬冠狀病毒，與蝙蝠 SARS 樣冠狀病毒同源性超過85%，具有高度的傳染性[7]。《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術指南(第四版)》中指出SARS-CoV-2對紫外線和熱敏感，56 ℃ 30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒[8]。

在實驗室檢測中如何能降低實驗風險，這對全國范圍內(nèi)各級醫(yī)療機構開展核酸檢測有著非常重要的作用，目前可采用前處理滅活病毒方式降低實驗人員感染的風險。本研究發(fā)現(xiàn)，未滅活組和滅活組Ct值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在未滅活組ORF基因Ct值為22～26時，未滅活處理和各滅活組ORF基因、N基因Ct值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這與陳培松等[9]研究結果一致。隨著未滅活組ORF基因Ct值增加，滅活組ORF基因Ct值相應也會增大，但是當未滅活組ORF基因Ct值>36時，滅活組ORF基因Ct值增加更大，Ct值會超過40，依據(jù)試劑盒說明書要求Ct值>40判為陰性，由此會出現(xiàn)漏檢的可能。在滅活組中60 ℃水浴30 min和56 ℃水浴45 min Ct值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，兩種滅活方式相差不大，而75%乙醇30 min相比60 ℃水浴30 min和56 ℃水浴45 min處理，Ct值增加更多，當未滅活處理Ct值≥34時，75%乙醇30 min處理就有可能會超過40，從而判為陰性。本研究中12份標本(標本號1、6、8、9、11、14、15、18、19、20、23、24)未滅活時ORF基因Ct值≥34，標本14、15、23和24號如果選擇滅活處理就非常有可能判為陰性，造成漏篩。本研究發(fā)現(xiàn)滅活處理確實會造成RNA降解，特別是當標本攜帶病毒水平比較低時，滅活處理對檢測結果影響較大，有可能造成漏檢，這也與段秀枝等[10]研究結果一致。

由此可見，物體表面攜帶SARS-CoV-2的標本在核酸檢測前進行滅活處理，核酸檢測陽性結果有可能轉陰，采用75%乙醇30 min處理相比60 ℃水浴30 min和56 ℃水浴45 min處理轉陰的概率更大。因此，在保障生物安全的前提下，是否進行標本滅活處理，各實驗室需慎重選擇，避免出現(xiàn)漏檢。

本研究分析了采用不同滅活方式對物體表面SARS-CoV-2核酸檢測結果的影響，這是目前實驗室檢測過程中遇到的現(xiàn)實問題，市一級疾病預防控制中心為了確保后續(xù)研究和滿足陽性標本的復核需要，一般不進行滅活檢測，但是目前開展檢測的醫(yī)療機構都對擬檢測標本進行了滅活，而且滅活的條件還不盡相同，遇到核酸滴度很低的標本時極易漏檢，而這種漏檢在特殊情況下有較大傳播風險，尤其是在大面積篩查時應注意這種風險。另外，由于滅活會升高臨床檢測標本的Ct值，而這在實際檢測中會導致該類滅活標本(臨界標本)結果不易判讀，結果經(jīng)常出現(xiàn)單靶標陽性，復核也不易得到準確結果，造成漏檢或誤判。因此，在高度懷疑標本為陽性標本時不建議事先進行滅活處理，可以在做好個人防護的情況下利用提取核酸的過程完成滅活，這樣能盡量避免漏檢。

本研究中的實驗室數(shù)據(jù)還比較粗糙，樣本量較小，還不能很好地推廣結論。因此，建議擴大樣本量，并使用其他高靈敏度的方法或抗原抗體方法來驗證是否漏檢，以進行更可靠的評價。