MFAP5在非小細胞肺癌組織中的表達情況及其對癌細胞增殖和轉移的影響*

王玉環，馬 進，巴 圖

新疆維吾爾自治區人民醫院病理科，新疆烏魯木齊 830001

2018年流行病學數據顯示，肺癌在中國所有惡性腫瘤中發病率最高，每年新發病例約78.1萬例[1]。肺癌中非小細胞肺癌(NSCLC)最為常見。NSCLC的組織學類型包括腺癌、鱗癌和大細胞癌[2]。近年來，包括靶向治療在內的新興治療方法為NSCLC的治療帶來較理想的效果[3]。因此，開發新的治療靶點對于改善NSCLC疾病現狀具有重要意義。微纖維相關蛋白5(MFAP5)是一種多功能分泌蛋白，在彈性微纖維整合、細胞行為調控和細胞存活中發揮重要作用[4]。研究表明，MFAP5可作為肝內膽管細胞癌診斷和預后的生物標志物，MFAP5表達上調是侵襲性肝內膽管細胞癌患者組織的共同特征[5]。此外，已有相關研究表明，MFAP5的過度表達與頭頸鱗癌淋巴結轉移和預后差有關，MFAP5促進缺氧誘導的頭頸鱗癌遷移、侵襲和上皮-間充質轉化(EMT)，MFAP5是一個較為理想的頭頸鱗癌治療靶點[6]。目前，關于MFAP5在NSCLC中的作用還尚不明確。因此，本研究旨在探討MFAP5與NSCLC疾病進展的關系及其對癌細胞的影響，以期為研究新的NSCLC臨床治療靶點提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年4月至2019年8月于本院經外科手術切除的NSCLC患者的癌組織及其對應的癌旁組織各87例。患者年齡41～84歲，平均(62.71±13.00)歲，中位年齡62歲;病理類型：腺癌44例，鱗癌38例，其他5例；TNM分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期21例，Ⅲ期26例，Ⅳ期32例。納入標準：術前未接受過放化療等輔助治療；具有完整的臨床病理資料；未合并其他腫瘤；無自身免疫系統疾病；無重要器官嚴重衰竭或功能不全。本研究經本院倫理委員會審核、批準(倫理批號：20170124015)，所有患者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2細胞和試劑 人NSCLC細胞A549和人正常肺上皮細胞BEAS-2B(中國科學院細胞庫)；MFAP5、神經型鈣黏蛋白(N-cadherin)、上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和GAPDH抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)；sh-NC和sh-MFAP5慢病毒液(上海吉滿生物科技有限公司)；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(Q111-02/03)和CCK-8(A311-01)購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1免疫組化 NSCLC組織及其對應的癌旁組織用4%多聚甲醛固定72 h后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明。石蠟包埋、切片。切片脫蠟至水，經抗原修復、封閉后，添加MFAP5抗體(1∶100)4 ℃過夜孵育。二抗(1∶500)37 ℃孵育1 h。DAB顯色，蘇木精復染，1%鹽酸乙醇溶液分化。切片常規脫水、透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡觀察分析。參考文獻[7]，根據染色細胞數目和染色程度對免疫組化結果進行評分。其中，0～4分為低表達，5～12分為高表達。

1.3.2細胞分組及慢病毒感染 A549和BEAS-2B細胞用含10% FBS的RPMI-1640培養基，置于37 ℃、5% CO2培養箱中靜置培養。待細胞密度達到80%～90%時，胰酶液消化細胞，將部分A549細胞接種于6孔板(1×106個/孔)培養24 h后，用sh-NC和sh-MFAP5慢病毒液(MOI=20)分別感染A549細胞，并在感染48 h后，更換含有嘌呤霉素(2 μg/mL)的培養基篩選培養72 h，分別作為sh-NC組及sh-MFAP5組;不進行病毒感染操作的A549細胞作為空白對照組，BEAS-2B細胞不進行感染操作。

1.3.3實時熒光定量反轉錄PCR(qRT-PCR)檢測 收集A549空白對照組、BEAS-2B組、sh-NC組及sh-MFAP5組細胞，Trizol試劑提取細胞總RNA。將RNA反轉錄為cDNA，并按照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix說明書所示，進行qRT-PCR。反應程序：95 ℃、5 min；95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，40個循環；95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算MFAP5 mRNA表達。MFAP5正向引物：5′-GCC AGC CAA AGT AGG AAC AG -3′；MFAP5反向引物：5′-AGC AAG AAA CAG CAG CAC CT-3′；GAPDH正向引物：5′-GGT CAC CAG GGC TGC TTT TA-3′；GAPDH反向引物：5′-GGA TCT CGC TCC TGG AAG ATG-3′。

1.3.4Western blot檢測 收集空白對照組、sh-NC組及sh-MFAP5組A549細胞和BEAS-2B細胞，裂解液裂解細胞，收集上清液并測定其蛋白濃度。各取30 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠電泳，分離后的蛋白轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。5%脫脂奶粉室溫條件下封閉3 h，加入MFAP5(1∶2 000)、N-cadherin(1∶1 000)、E-cadherin(1∶1 000)、Vimentin(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)抗體稀釋液，4 ℃條件下孵育過夜。加入二抗(1∶5 000)，室溫條件下孵育1 h。滴加ECL發光液，凝膠成像系統檢測蛋白條帶，Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度值。

1.3.5CCK-8檢測 將處于對數生長期的空白對照組、sh-NC組及sh-MFAP5組細胞接種于96孔板中(5×103個/孔)。細胞繼續培養24、48和72 h后，參照CCK-8說明書，檢測各孔在450 nm處的吸光度(A450)值。

1.3.6克隆形成試驗 將對處于對數生長期的空白對照組、sh-NC組及sh-MFAP5組細胞均勻接種于培養皿中，每皿接種300個細胞。細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱中連續培養2周。4%多聚甲醛室溫固定細胞15 min。吉姆薩染色液染色10 min后，流水沖洗，空氣干燥。肉眼直接計數克隆數。

1.3.7細胞劃痕試驗 將處于對數生長期的空白對照組、sh-NC組及sh-MFAP5組細胞接種于6孔板中(5×105個/孔)。24 h后，將槍頭垂直于6孔板，沿著直尺進行劃痕。細胞經PBS清洗后，加入無血清培養基。細胞繼續培養24 h后拍照，Image J軟件分析細胞劃痕愈合率。

1.3.8Transwell試驗 將空白對照組、sh-NC組及sh-MFAP5組細胞接種于提前鋪有Matrigel的Transwell上室(5×104個/孔)。將600 μL含10% FBS的RPMI1640培養基加至下室，細胞繼續培養24 h。24 h后，取出小室，4%多聚甲醛固定15 min，加入結晶紫染色液染色15 min。顯微鏡觀察細胞侵襲情況。

2 結 果

2.1NSCLC組織及其癌旁組織中MFAP5的表達 與癌旁組織相比，NSCLC組織中MFAP5 免疫組化評分明顯升高，差異有統計學意義(t=11.238，P<0.001)，MFAP5高表達率差異有統計學意義(χ2=37.286，P<0.001)。見圖1和表1。

圖1 免疫組化檢測NSCLC組織及其癌旁組織中MFAP5的表達(×100)

表1 NSCLC組織及其癌旁組織中MFAP5表達的比較

2.2MFAP5與NSCLC臨床病理特征的關系 NSCLC組織中MFAP5表達水平與患者淋巴結轉移、TNM分期有關(P<0.05)，而與患者年齡、性別、吸煙史和組織學類型無關(P>0.05)。見表2。

表2 NSCLC組織中MFAP5表達水平與NSCLC臨床病理特征的關系(n)

續表2 NSCLC組織中MFAP5表達水平與NSCLC臨床病理特征的關系(n)

2.3A549和BEAS-2B細胞中MFAP5的表達 與人正常肺上皮細胞BEAS-2B細胞相比，NSCLC上皮細胞A549細胞中MFAP5 mRNA和蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2、表3。

圖2 Western blot檢測細胞中MFAP5蛋白表達

表3 兩組細胞中MFAP5 mRNA和蛋白表達的比較

2.4敲低MFAP5對NSCLC細胞增殖的影響 與空白對照組相比，sh-NC組細胞中MFAP5 mRNA和蛋白表達、細胞活力和克隆形成數，差異均無統計學意義(P>0.05)；與sh-NC組相比，sh-MFAP5組細胞中MFAP5 mRNA和蛋白表達、細胞活力和增殖能力明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3、4，表4、5。

圖3 Western blot檢測細胞中MFAP5蛋白表達

圖4 克隆形成試驗檢測細胞增殖能力

表4 各組細胞中MFAP5 mRNA和蛋白表達的比較

表5 各組細胞活力和增殖能力的比較

2.5敲低MFAP5對NSCLC細胞遷移和侵襲的影響 與A549空白對照組相比，sh-NC組細胞劃痕愈合率和侵襲細胞數差異無統計學意義(P>0.05)；與sh-NC組相比，敲低MFAP5后的sh-MFAP5組細胞劃痕愈合率和侵襲細胞數明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5、6和表6。

圖5 細胞劃痕試驗檢測細胞遷移能力(×100)

圖6 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力(×200)

表6 各組細胞遷移和侵襲能力的比較

2.6敲低MFAP5對NSCLC細胞EMT的影響 與空白對照組相比，sh-NC組細胞N-cadherin、E-cadherin和Vimentin表達差異無統計學意義(P>0.05)；與sh-NC組相比，sh-MFAP5組細胞N-cadherin和Vimentin蛋白表達明顯降低，E-cadherin蛋白表達明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖7、表7。

表7 各組細胞中N-cadherin、E-cadherin和Vimentin蛋白表達的比較

圖7 Western blot檢測細胞中N-cadherin、E-cadherin和Vimentin蛋白表達

3 討 論

雖然近年來診斷技術和治療方法有了實質性的進步，但是NSCLC患者的5年相對存活率仍約為15%[8]。此外，早期診斷NSCLC仍然是一個較大的挑戰。大多數NSCLC患者被診斷為中晚期[9]。靶向治療已成為NSCLC患者疾病管理的重要手段。新的分子靶點的發現，如microRNAs，表皮生長因子受體和erb-b2受體酪氨酸激酶3等，促使新的治療方法的發展。靶向治療可能最終改變肺癌的治療模式，為治療選擇有限的患者帶來希望[10]。因此，有必要進一步研究NSCLC的病因，確定與其相關的確切發病機制，這可能有助于開發獨特的診斷生物標志物和治療靶點。

MFAP5基因是在人類癌癥中廣泛表達的基因之一，參與多種癌癥進展。在舌鱗狀細胞癌中，MFAP5的過度表達與頸中央區淋巴結轉移、無轉移復發生存率和總生存率相關，提示MFAP5可能是預測口腔舌癌頸淋巴結轉移和預后的潛在指標[11]。在乳腺癌中，MFAP5的高表達與腫瘤晚期、高級別腫瘤、淋巴結轉移、較低的3年無復發生存率和較低的3年總生存率相關，MFAP5是一種新的乳腺癌預后生物標志物，是乳腺癌的潛在治療靶點[12]。WEI等[13]發現MFAP5在結直腸癌樣本和細胞中表達上調。MFAP5的上調與結直腸癌患者的Dukes分期、分化狀態和局部淋巴轉移等臨床病理特征有關。目前，關于MFAP5與NSCLC疾病進展的關系尚不明確。本研究結果顯示，與癌旁組織相比，NSCLC組織中MFAP5 免疫組化評分明顯升高；與人正常肺上皮細胞BEAS-2B相比，上皮細胞A549的MFAP5表達量明顯上升。通過進一步分析發現，MFAP5的高表達與患者淋巴結轉移和TNM分期有關，而與患者年齡、性別、吸煙史和組織學類型無關。該結果表明，MFAP5與NSCLC疾病進展密切相關，可能是NSCLC的潛在治療靶點。

EMT是一個動態的、高度調控的過程，發生在胚胎發生和腫瘤進展過程中，賦予上皮細胞運動性、干性和治療抵抗力。EMT仍然是癌癥治療的一個有吸引力的靶點[14]。潛在的抗EMT策略可能包括逆轉EMT、直接靶向表達EMT的細胞，或者誘導EMT細胞轉分化為無害的細胞類型[15]。目前，已有研究表明，MFAP5在人類宮頸癌組織和細胞系中過度表達。抑制宮頸癌細胞中的MFAP5通過調節EMT相關信號通路，顯著降低細胞的增殖、遷移和侵襲，從而發揮抗腫瘤作用[16]。N-cadherin、E-cadherin和Vimentin是重要的EMT標志物。MFAP5是膀胱癌發生發展的重要致癌基因，與患者生存率低有關。MFAP5的下調可抑制膀胱癌細胞增殖和侵襲[17]。同樣的，CHEN等[18]的研究結果顯示，MFAP5通過激活Notch1信號通路，從而促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲。鑒于MFAP5可能為NSCLC的潛在治療靶點，本研究敲低MFAP5在NSCLC上皮細胞A549中的表達，結果顯示，與sh-NC組相比，sh-MFAP5組細胞N-cadherin和Vimentin蛋白表達明顯降低，E-cadherin蛋白表達明顯升高。CCK-8檢測、克隆形成試驗、細胞劃痕試驗及Transwell試驗進一步驗證，敲低 MFAP5可抑制NSCLC細胞增殖、遷移、侵襲和EMT。該研究結果表明，MFAP5是NSCLC進展中的重要致癌基因。

綜上所述，本研究結果表明，NSCLC組織中MFAP5的高表達與疾病進展密切相關，敲低MFAP5可發揮明顯的抗腫瘤作用。該研究結果為明確NSCLC發病機制及開發新的治療靶點提供了新的科學資料。MFAP5在NSCLC中的具體作用機制值得進一步研究。